微生物ITS扩增子测序

微生物ITS扩增子测序：探索真菌多样性的利器

在揭示复杂微生物群落奥秘的过程中，扩增子测序技术扮演着核心角色。其中，针对真菌群落的内源转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）扩增子测序，已成为研究真菌多样性、群落结构与功能的黄金标准。其核心原理在于利用真菌高度保守的核糖体DNA（rDNA）区域设计特异性引物，对包含高度变异的ITS区片段进行靶向扩增和深度测序，从而实现对复杂样本中真菌组成的精细解析。

技术核心：ITS区域的特异性与重要性

• 位置与结构： 真菌rDNA基因簇按顺序排列为：18S rRNA基因 - ITS1 - 5.8S rRNA基因 - ITS2 - 28S rRNA基因。
• 关键特性：
  • 高度保守区域（18S, 5.8S, 28S）： 功能稳定，序列保守，适合设计通用引物。
  • 高度可变区域（ITS1 和 ITS2）： 进化速率快，种内相对保守，种间差异显著，是理想的物种分辨率标记。
  • 通用性： ITS区存在于所有真菌基因组中。
  • 高拷贝数： rDNA在基因组中通常存在多拷贝，利于从复杂样本中检出低丰度真菌。

ITS扩增子测序的关键流程

1. 样本采集与核酸提取：

   • 根据研究目标（土壤、水体、植物根际、动物肠道、空气、临床样本等）采集代表性样本。
   • 使用优化的方法（手工法或商品化试剂盒）提取样本总DNA/RNA（通常逆转录为cDNA）。提取质量（完整性、浓度、纯度、去除抑制剂）是下游成功的基石。

2. 引物设计与PCR扩增：

   • 靶标选择： 通常首选ITS1区或ITS2区进行扩增（ITS1提供略高的分辨率，ITS2数据库更成熟）。全长ITS亦可，但扩增效率可能受样本复杂性影响。
   • 引物设计： 选择广泛验证、覆盖度高的通用引物对（例如 ITS1F/ITS2 用于ITS1区， ITS3/ITS4 用于ITS2区）。
   • PCR 优化： 严格控制循环数（通常25-35），优化反应条件（退火温度、镁离子浓度等），使用高保真酶以减少错误引入，并添加样本特异的标签序列（Barcode/Multiplex Identifier）以实现后续样本混合测序（Multiplexing）。通常需要多重复PCR以降低随机误差影响。

3. 扩增子文库制备与高通量测序：

   • PCR产物纯化： 去除引物二聚体、非特异性扩增产物及残留试剂。
   • 文库构建： 将纯化后的、带有Barcode的扩增子片段连接到测序适配器（Adapter）上，构建成适用于高通量测序平台的文库。
   • 文库质检与定量： 通过荧光定量、电泳等手段评估文库质量及浓度。
   • 高通量测序： 主要在第二代测序平台（如Illumina）上进行双端（Paired-End, PE）测序（如 PE250, PE300），生成数百万至数千万条序列读长（Reads）。

4. 生物信息学分析：

   • 原始数据质控： 去除低质量序列、去除接头序列、去除引物序列、去除嵌合体序列。
   • 序列拼接（PE Reads）： 将成对Reads基于重叠区拼接成更长的单条序列（Tags/Contigs）。
   • 操作分类单元聚类：
     • OTU法： 按序列相似性（通常97%为种水平阈值）将序列聚类成OTU，代表性序列比对数据库（如UNITE, ITS RefSeq）进行物种注释。
     • ASV法： 使用DADA2、Deblur等算法识别单碱基精度的扩增子序列变异体，分辨率更高，避免主观阈值设定。
   • 物种组成分析： 获得各样本中真菌的物种构成（门、纲、目、科、属、种水平）及相对丰度。
   • 群落多样性分析： 计算Alpha多样性（单个样本内的丰富度、均匀度、多样性指数如Shannon, Simpson, Chao1）和Beta多样性（样本间群落结构差异，常用PCoA, NMDS，基于距离矩阵如Bray-Curtis, Unifrac）。
   • 差异分析： 识别不同分组（如疾病组vs健康组，不同处理组）间显著差异的物种（OTU/ASV）或类群。
   • 功能预测分析（可选）： 基于已知物种功能信息（如FUNGuild, FUNGuild）预测群落的功能潜能。
   • 统计分析： 应用多元统计方法（如PERMANOVA, ANOSIM）检验群落结构差异显著性，利用机器学习（如LEfSe, Random Forest）寻找关键生物标志物。

ITS扩增子测序的优势

1. 真菌特异性高： 引物专为真菌设计，有效规避细菌、古菌等微生物干扰。
2. 分辨率优良： ITS区变异大，通常能区分至属甚至种水平（尤其ASV方法）。
3. 灵敏度高： 适用于分析低生物量或复杂样本中的稀有真菌。
4. 高通量、低成本： 可同时并行分析大量样本，获取海量数据，单位数据成本低。
5. 数据库成熟： ITS区域具有庞大且持续更新的专业真菌参考数据库（如UNITE, NCBI ITS RefSeq）。
6. 标准化流程： 实验和分析流程相对成熟、易于标准化，利于不同研究间比较。

应用领域广泛

• 环境微生物学： 研究土壤、水体、大气中真菌群落结构对环境变化（污染、气候变化、土地利用）的响应与指示作用。
• 植物微生物组： 解析根际、叶际、内生真菌群落，研究其与植物健康、共生、抗病性的关系。
• 人体微生物组： 探索肠道、口腔、皮肤、呼吸道等部位的真菌组（Mycobiome）在健康和疾病（如炎症性肠病、肥胖、过敏、真菌感染）中的作用。
• 食品与发酵工业： 监测发酵过程（如酒、酱油、奶酪）中真菌群落演替，保证食品安全与风味品质。
• 生物技术与医药： 挖掘具有特殊功能（如生物降解、抗生素生产、生物防治）的真菌资源。
• 生态学： 研究真菌在生态系统物质循环（如碳氮循环、凋落物分解）中的关键功能及物种互作网络。

面临的挑战与局限性

1. 引物偏好性： 任何通用引物都无法100%覆盖所有真菌类群，不同引物组合对群落结构的反映存在偏差。
2. 数据库局限性： 参考数据库仍不完善，大量环境微生物尚未被培养和测序，导致部分序列无法注释或注释错误。
3. PCR扩增偏好与误差： PCR过程中的偏好性和错误引入（虽可通过高保真酶优化）会影响定量准确性。
4. 功能信息间接： ITS是分类标记物，主要反映“谁在哪儿”，不直接反映活性或功能，功能预测基于已知物种关联，存在不确定性。
5. 拷贝数变异： 不同真菌rDNA拷贝数差异巨大，使得基于扩增产物的丰度估计难以反映真实细胞丰度（属半定量）。
6. 区分活菌与死菌： DNA检测无法有效区分活性真菌孢子、菌丝体与死亡/游离DNA。
7. 生物信息学复杂性： 分析流程涉及众多工具和参数选择，不同处理方法可能导致结果差异，需严谨评估。

未来发展趋势

• 长读长测序： 利用第三代测序技术（如PacBio, Nanopore）直接获得完整ITS序列（甚至全长rDNA簇），极大提升分辨率、简化分析流程、彻底解决拼接问题。
• 宏基因组/宏转录组整合： 将ITS测序与宏基因组测序（研究所有微生物基因）或宏转录组测序（研究活跃表达的基因）结合，更全面、更功能性地解析微生物群落。
• 单细胞技术： 应用单细胞测序技术深入研究稀有真菌物种或复杂群落中个体细胞的基因组和功能。
• 标准化与质量控制： 推动实验操作、数据分析和报告的国际标准化，加强样本保存、DNA提取、PCR条件及阴性/阳性对照的质量控制。
• 机器学习与大数据挖掘： 利用人工智能更深入地分析微生物组大数据，建立更精准的群落-环境/健康关联模型和预测工具。
• 培养组学结合： 加强分离培养难以培养的真菌，以验证测序结果、获取菌株资源并深入研究其生物学功能。

结论

ITS扩增子测序技术以其真菌特异性强、分辨率高、通量大、成本相对可控的优势，已成为描绘复杂样本中真菌群落组成与动态变化的强大工具。它极大地推动了环境微生物学、植物与人体微生物组学、生物技术等诸多领域的研究进展。尽管存在引物偏好性、数据库局限性、功能推测等挑战，但随着长读长测序技术的普及、多组学整合分析的深入以及标准化流程和质量控制的完善，ITS测序将继续在解密真菌王国奥秘、揭示微生物与宿主及环境相互作用机制方面发挥不可替代的关键作用，为解决环境、健康、农业等领域的重要问题提供关键的微观视角和科学依据。