尺寸排阻色谱分离检测

尺寸排阻色谱 (SEC) 技术详解：原理、应用与实践

一、 基本原理

尺寸排阻色谱 (Size Exclusion Chromatography, SEC)，又称凝胶渗透色谱 (GPC - 常用于有机溶剂体系) 或凝胶过滤色谱 (GFC - 常用于水溶液体系)，是一种基于溶质分子在溶液中的流体力学体积大小差异进行分离的液相色谱技术。

• 核心机制： 色谱柱内填充有多孔性填料颗粒。当含有不同大小分子的样品溶液流经色谱柱时：
  • 大分子： 因体积过大无法进入填料颗粒的大部分孔穴，只能通过颗粒间隙流动，流经路径较短，最先被洗脱出色谱柱。
  • 中等分子： 可部分进入填料的孔穴，流经路径较长，洗脱时间居中。
  • 小分子： 能够自由进入填料颗粒的大部分甚至所有孔穴，流经路径最长，最后被洗脱出色谱柱。
• 分离依据： 溶质分子的流体力学体积（与分子量、分子构型、溶剂化程度相关）。在相同实验条件下，分子量越大（流体力学体积越大），洗脱时间越早。
• 非相互作用性： SEC 的分离主要基于空间排阻效应，理想情况下，溶质分子与填料表面不发生吸附、离子交换或疏水等相互作用。洗脱溶剂（流动相）的主要作用是溶解样品并将分子按其大小输送出柱。

二、 仪器组成

一套典型的 SEC 系统主要包括以下组件：

1. 流动相系统：
   • 储液瓶： 盛装洗脱溶剂（缓冲液或有机溶剂）。
   • 脱气装置： 去除溶剂中溶解的气体，防止在泵或检测器中产生气泡干扰。
   • 高压输液泵： 提供稳定、无脉动的流动相流。
2. 进样系统：
   • 手动进样阀或自动进样器： 将精确体积的样品溶液引入流动相流中。
3. 色谱柱：
   • 核心部件： 柱管内填充有特定孔径分布和粒径的多孔性填料（如交联聚苯乙烯、硅胶、亲水性聚合物等）。填料的选择取决于待测样品的分子量范围和溶剂体系（水相或有机相）。
4. 检测系统：
   • 浓度型检测器：
     • 示差折光检测器 (RI)： 通用型，基于样品与流动相折射率差异，适用于大多数有机溶剂和水溶性聚合物、蛋白质等。灵敏度相对较低。
     • 紫外-可见光检测器 (UV-Vis)： 高灵敏度，要求样品分子在特定波长下有紫外或可见光吸收。常用于蛋白质、核酸、多肽、合成聚合物等。
   • 分子量敏感型检测器： 通常与浓度型检测器联用。
     • 光散射检测器 (LS)： 直接测定溶液中大分子的绝对分子量（无需标准品）和均方根半径（Rg）。分为多角度激光光散射 (MALLS) 和小角度激光光散射 (LALLS)。
     • 粘度检测器： 测量溶液的粘度，用于计算特性粘度和分子结构信息（如支化度）。
5. 数据采集与处理系统：
   • 色谱工作站： 控制仪器运行参数，采集检测器信号，进行数据处理（如绘制色谱图、计算保留时间、峰面积/高度、分子量分布等）。

三、 方法开发与操作要点

1. 色谱柱选择：
   • 填料基质： 根据样品溶解性选择亲水性（水相 SEC）或疏水性（有机相 SEC）填料。
   • 孔径范围： 选择其分离范围能覆盖目标样品分子量分布的色谱柱。通常需要根据样品预估分子量查阅色谱柱说明书。
2. 流动相选择：
   • 溶剂： 必须能充分溶解样品，且与色谱柱填料兼容（不溶解或破坏填料）。
   • 缓冲液： 对于生物大分子（如蛋白质），常使用缓冲盐溶液（如磷酸盐、Tris-HCl）以维持样品稳定性和抑制非特异性吸附。缓冲液 pH 值和离子强度是关键参数。
   • 添加剂： 有时需加入少量添加剂（如有机溶剂、表面活性剂、盐）以改善峰形、防止吸附或聚集（如 0.1-0.3 M NaCl 常用于减少蛋白质与填料的离子相互作用）。
3. 流速优化：
   • 流速影响分离效率和运行时间。通常根据色谱柱内径和长度，在推荐流速范围内选择。较低的流速通常能提供更好的分离度，但耗时较长。
4. 样品制备：
   • 溶解： 样品必须完全溶解于流动相（或与流动相成分接近的溶剂），无颗粒物。
   • 浓度： 浓度过高可能导致色谱柱过载、峰变形或分子间聚集。需根据检测器灵敏度优化。
   • 过滤： 样品溶液应使用合适孔径（通常 0.22 μm 或 0.45 μm）的滤膜过滤，以去除颗粒物，保护色谱柱。
5. 温度控制：
   • 柱温箱用于维持色谱柱温度恒定（通常室温或略高，如 25-40°C），温度波动会影响保留时间的重现性和分离效率。某些应用（如高温 SEC 分析聚烯烃）需要更高温度。

四、 主要应用领域

1. 生物大分子分析：
   • 蛋白质： 纯化分离、聚合体/片段分析、测定单体纯度、估算分子量（需用标准蛋白校正）。
   • 单克隆抗体 (mAb)： 表征大小变异体（单体、聚体、片段）。
   • 核酸 (DNA/RNA)： 分析片段大小分布、纯化特定大小的片段。
   • 病毒/疫苗： 分析病毒颗粒大小、聚集状态。
2. 合成与天然高分子表征：
   • 分子量分布 (MWD) 测定： SEC 是测定聚合物（如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙二醇、多糖、木质素等）分子量分布的最常用方法。需使用窄分布聚合物标准品建立校正曲线。
   • 绝对分子量测定： 联用光散射检测器可直接测定绝对重均分子量 (Mw) 和均方根半径 (Rg)。
   • 支化度分析： 联用粘度检测器，通过 Mark-Houwink 图分析聚合物链结构（线型 vs 支化）。
3. 聚合物产品质量控制：
   • 监测合成产物分子量分布是否符合规格。
   • 检测降解产物或低聚物。
4. 其它应用：
   • 分离复杂混合物中的不同尺寸组分。
   • 脱盐或缓冲液置换（例如，蛋白质样品除盐）。

五、 优势与局限

• 优势：
  • 分离温和，适用于生物大分子等活性物质。
  • 提供分子量分布信息，对聚合物的表征至关重要。
  • 分离基于分子尺寸，原理相对简单直观。
  • 样品回收率高。
• 局限：
  • 分辨率相对低于其他 HPLC 模式（如反相色谱、离子交换色谱）。
  • 峰容量有限（一次运行能分离的组分数量较少）。
  • 分子量测定依赖于校正曲线（传统方法），或需要昂贵的光散射检测器（绝对法）。
  • 存在非尺寸排阻效应（如吸附、离子相互作用）干扰的风险，需仔细优化条件抑制。

六、 常见问题与解决思路

1. 峰形拖尾或前伸：
   • 原因： 色谱柱污染/塌陷、样品过载、填料与样品发生非特异性吸附、溶剂效应（样品溶剂与流动相不匹配）。
   • 解决： 清洁或更换色谱柱；降低进样量/浓度；优化流动相（如调整缓冲液 pH、离子强度、加入添加剂抑制吸附）；确保样品溶解在流动相或弱溶剂中。
2. 保留时间不重现：
   • 原因： 流速不稳定、温度波动、色谱柱未平衡、流动相组成变化、色谱柱污染/损坏。
   • 解决： 检查泵系统；使用柱温箱；确保色谱柱在使用前用流动相充分平衡（通常 5-10 倍柱体积）；保持流动相新鲜并正确配制；维护或更换色谱柱。
3. 柱压异常升高：
   • 原因： 系统管路或在线过滤器堵塞、色谱柱入口筛板堵塞（通常由颗粒物或沉淀引起）。
   • 解决： 分段检查系统（卸下色谱柱测试压力），更换或清洗堵塞部件；确保样品和流动相经过充分过滤（0.22 μm）；按说明书清洗色谱柱。
4. 分离度不足：
   • 原因： 色谱柱选择不当（孔径范围不匹配）、流速过快、色谱柱老化、样品分子量差异太小。
   • 解决： 更换更合适孔径范围的色谱柱；降低流速；更换新色谱柱；考虑使用其他具有更高分辨率的分离技术（如需要分离同分异构体或分子量非常接近的物质）。
5. 回收率低：
   • 原因： 样品在色谱柱或系统中有吸附或滞留。
   • 解决： 优化流动相（如调整 pH、离子强度、加入添加剂）；尝试不同批号或类型的色谱柱；检查系统管路是否清洁。

总结

尺寸排阻色谱作为一种基于分子尺寸差异进行分离的经典色谱技术，在生物制药、高分子科学、材料研究等领域扮演着不可或缺的角色。其核心价值在于能够温和地分离生物活性分子以及精确表征聚合物的分子量及其分布。成功应用 SEC 的关键在于深入理解其分离原理，并针对特定样品属性（溶解性、分子量范围、稳定性）和分离目标（纯度分析、分子量测定、分离制备）进行细致的色谱柱选择、流动相优化和实验条件控制。通过规避非尺寸排阻效应的影响并妥善维护色谱系统，SEC 能够提供可靠且信息丰富的分析结果。