微生物18S扩增子测序

微生物18S rRNA基因扩增子测序：原理、流程与应用

1. 什么是18S rRNA基因扩增子测序？

18S rRNA基因扩增子测序是一种基于高通量测序技术的分子生物学方法，专门用于研究环境中真核微生物的群落组成与多样性。其核心原理是：

• 靶向扩增： 提取环境样本（土壤、水体、肠道内容物等）总DNA后，使用特异性引物对微生物核糖体小亚基（18S rRNA）基因上特定的、具有遗传多样性的片段（称为“高变区”，如V4、V9）进行PCR扩增。
• 高通量测序： 将扩增得到的混合产物（即“扩增子”）进行高通量测序，产生海量短序列读长（reads）。
• 生物信息学分析： 对测序数据进行质量控制和生物信息学处理（如聚类或去噪生成操作分类单元OTU或扩增序列变体ASV），通过与参考数据库比对，鉴定样本中存在的真核微生物种类及其相对丰度。

2. 技术流程详解

• (1) 样本采集与保存：
  • 根据研究目标（如海洋浮游生物、土壤原生生物、肠道寄生虫）采集代表性样本（水样、土样、粪便等）。
  • 立即使用适当方法（如液氮速冻、-80°C保存、专用保存液）稳定样本，抑制微生物活动与核酸降解。
• (2) 总DNA提取：
  • 使用针对特定样品类型（如含腐殖质的土壤、低生物量的水体）优化的商业化DNA提取试剂（需有效裂解真核细胞壁/膜）。
  • 关键点：最大限度获取高质量、完整的DNA，同时去除PCR抑制剂（腐殖酸、多酚等）。
• (3) PCR扩增 (核心步骤)：
  • 引物设计： 选择扩增目标高变区（常用V4或V9区）的通用引物，尽可能覆盖广泛的真核微生物类群（原生动物、微藻、真菌等）。常用引物示例（仅供参考具体选择需依据研究目标）：
    • V4区：TAReuk454FWD1 / TAReukREV3
    • V9区：1380F / 1510R
    • 需注意引物对真菌、藻类、原生动物等不同类群的偏好性差异。
  • PCR体系优化： 严格控制反应条件（循环数、退火温度、Mg²⁺浓度），采用高保真聚合酶，最大限度减少扩增偏好性和嵌合体形成。
  • 应对宿主污染： 若样本含宿主真核DNA（如粪便样本），可采用：1) 设计避开宿主保守区的引物；2) 使用阻断肽核酸（PNA）或锁核酸（LNA）寡核苷酸抑制宿主DNA扩增；3) 巢式PCR策略。
  • 重复与对照： 设置技术重复评估扩增重现性，设置阴性对照（无模板）监测污染，设置阳性对照评估扩增效率。
• (4) 扩增子文库构建与质检：
  • 对PCR产物进行纯化，移除引物二聚体和小片段。
  • 连接测序平台兼容的接头（含样本特异性条形码/Barcode，用于混合测序后区分样本）。
  • 使用荧光计或自动化电泳系统定量和评估文库片段大小分布及质量。
• (5) 高通量测序：
  • 将各样本的带条形码文库按一定比例混合（Pooling）。
  • 在主流的高通量测序平台上（如Illumina MiSeq/NovaSeq）进行双端（Paired-end, PE）测序（如2×250 bp或2×300 bp），以覆盖目标片段并提高序列准确性。
• (6) 生物信息学分析：
  • 原始数据处理： 去除低质量碱基、接头序列；根据条形码拆分样本；合并双端读长。
  • 质量控制与过滤： 剔除长度不符、含模糊碱基（N）、平均质量值过低的序列。
  • 去噪与生成特征表： 主要两种策略：
    • OTU聚类： 按预设相似度阈值（通常97%）将序列聚类成OTU；生成OTU丰度表。
    • ASV生成： 使用DADA2、Deblur或UNOISE3等算法对错误校正后的精确序列变体进行推断（分辨率更高）；生成ASV丰度表。
  • 物种注释： 将代表性序列（OTU中心序列或ASV序列）与专业的18S数据库（如PR², SILVA, Protist Ribosomal Reference database）进行比对，赋予分类学信息（界、门、纲、目、科、属、种）。置信度阈值需谨慎设置。
  • 统计分析： 核心分析包括：
    • α多样性： 评估单个样本内的多样性（丰富度如Observed OTUs/ASVs, Chao1；均匀度如Shannon, Simpson；综合指标如Faith's PD）。
    • β多样性： 评估样本间群落组成差异（基于Bray-Curtis距离、UniFrac距离等的PCoA、NMDS、聚类分析）。
    • 差异分析： 找出不同组间（如处理组vs对照组）显著差异的类群（LEfSe, DESeq2, ANCOM等）。
    • 群落结构分析： 绘制类群相对丰度堆叠图、网络分析揭示物种共现关系、功能预测等（后者在18S中不如16S成熟）。
  • 数据可视化： 使用R语言生态系统（ggplot2, phyloseq, Vegan）或专业生物信息学平台进行绘图。

3. 核心应用领域

• 真核微生物群落结构与多样性调查： 揭示自然（海洋、淡水、土壤）和人工（活性污泥、生物滤池）生态系统中原生动物、真菌、藻类等的组成、分布模式及其驱动因子（环境参数、空间尺度、宿主等）。
• 寄生虫检测与流行病学研究： 高效筛查环境样本（水、土壤）、临床样本（粪便、组织）或载体样本中的寄生虫（如贾第虫、隐孢子虫、微孢子虫、吸虫），评估感染风险，追踪传播途径。
• 微藻监测与研究： 研究浮游植物群落动态（赤潮/水华形成机制）、深海或极端环境藻类多样性、生物燃料藻种筛选等。
• 宿主相关微生物组研究： 解析动物肠道、瘤胃或植物根际、叶际等环境中原生生物、真菌等真核微生物的组成及其与宿主健康、营养、发育的关系。
• 生物指示与生态评估： 利用原生动物等对环境变化（污染、富营养化、气候变化）敏感的特性，将其群落变化作为生物指示器评价生态系统健康状况（如水质生物监测）。

4. 技术优势与局限性

• 优势：
  • 通量高、成本相对低： 可同时分析数百个样本，获取群落整体信息。
  • 不依赖培养： 能检测环境样本中绝大多数不可培养的真核微生物。
  • 高灵敏度： 可检出低丰度物种。
  • 分辨率： ASV方法提供亚种水平的分辨率。
  • 标准化流程： 适用于大规模的、可重复的比较研究。
• 局限性：
  • PCR偏好性： DNA提取效率、引物选择偏好、PCR扩增效率差异会引入偏差，影响群落组成的真实反映。
  • 分辨率限制： 即使ASV分辨率高，基于单一基因（18S）有时难以区分近缘种或达到物种水平的精确鉴定（受限于数据库质量）。
  • 数据库挑战： 18S数据库对某些真核微生物类群（尤其稀有类群、未知类群）的覆盖度和准确性不如细菌16S数据库完善。
  • 功能信息缺失： 仅提供分类学信息，无法直接获取微生物的功能基因或代谢能力信息（通常需结合宏基因组或宏转录组）。
  • 宿主污染干扰： 在宿主相关的样本中，宿主DNA可能占据主导，掩盖目标微生物信号。
  • 绝对丰度未知： 提供的是相对丰度（比例），无法直接得知微生物细胞的实际数量（可与qPCR或流式细胞术结合）。

5. 总结

18S rRNA基因扩增子测序是深入研究环境及宿主相关真核微生物（原生动物、真菌、藻类、寄生虫）群落结构和多样性的强大工具。其核心在于通过特异性扩增18S rRNA基因的高变区并进行高通量测序，结合生物信息学分析，实现对复杂群落中难以培养微生物的鉴定和定量。虽然存在PCR偏好性、数据库挑战和无法提供功能信息等局限，其在生态学、环境科学、寄生虫学、水产学和人体微生物组研究等领域已展现出巨大价值。

随着测序技术的进步、更优引物的开发、数据库的不断扩充完善以及生物信息学分析方法的革新（如ASV应用），18S扩增子测序的分辨率、准确性和应用广度将持续提升。未来，将其与其他组学技术（宏基因组、宏转录组）或显微技术结合，将更全面地揭示真核微生物的生态功能及其与环境、宿主的互作机制。