发酵液中胞外囊泡的分离与检测：完整技术方案
胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的关键载体，在发酵工程（如益生菌发酵、微生物代谢产物研究）中扮演着重要角色。高效、准确地从成分复杂的发酵液中分离与检测EVs是深入研究其功能的基础。以下为完整的技术流程与要点：
一、发酵液样本前处理（关键步骤）
发酵液成分复杂（菌体碎片、未消耗培养基、代谢产物、蛋白质聚集体等），前处理至关重要：
- 低速离心： 去除菌体及大颗粒碎片（如：500 - 2,000 x g, 10 - 30分钟，4°C）。
- 中速离心： 进一步去除残余细胞碎片和较大颗粒（如：10,000 - 20,000 x g, 20 - 40分钟，4°C）。
- 过滤澄清： 使用0.22 μm或0.45 μm孔径滤膜过滤上清液，去除细小颗粒及部分大分子聚集体。注意选择低蛋白吸附滤膜。
- （可选）超滤浓缩： 若目标EVs浓度低，可使用特定截留分子量（如10 kDa或100 kDa）的超滤离心管浓缩滤液体积。
二、胞外囊泡分离富集
常用方法各有优缺点，需根据下游应用选择：
- 超速离心法（金标准）：
- 步骤： 将前处理后的上清液在4°C下进行超高速离心（如100,000 - 200,000 x g，持续60 - 120分钟）。
- 沉淀收集： 小心弃去上清，用适量无菌PBS或特定缓冲液（如0.32 M蔗糖溶液）轻柔重悬沉淀（即初步富集的EVs）。
- 洗涤： 为去除共沉淀污染物，可将重悬液再次用足量PBS稀释，重复超速离心步骤。
- 优点： 原理直接，无需额外试剂。
- 缺点： 耗时长（数小时），设备要求高，剪切力可能损伤囊泡，可能共沉淀非囊泡物质（如脂蛋白、蛋白聚集体）。
- 尺寸排阻色谱法（常用于去除可溶性蛋白污染）：
- 原理： 利用多孔凝胶填料，依据分子大小差异进行分离。大分子EVs先被洗脱，小分子污染物后被洗脱。
- 应用： 常用于超速离心所得EVs沉淀的进一步纯化，或直接分离前处理后的发酵液上清（需预先浓缩）。能有效去除大量可溶性蛋白和杂质。
- 优点： 分离条件温和，样品损失相对较小，可获得较纯净的EVs组分。
- 缺点： 分辨率有限，不同亚群EVs可能部分重叠，处理量相对较小。
- 聚合物沉淀法：
- 原理： 加入聚乙二醇（PEG）等聚合物改变溶液环境，促使EVs与其他大分子共同沉淀。
- 步骤： 按特定比例将聚合物溶液加入样品中，充分混匀后低温孵育（如4°C过夜），再经低速离心（如1500 - 10,000 x g, 30 - 60分钟）收集沉淀，最后用适量缓冲液重悬。
- 优点： 操作相对简单快速，无需超速离心机，可处理较大体积样本。
- 缺点： 纯度较差，会共沉淀大量非囊泡物质（如脂蛋白、多糖、蛋白复合物），可能引入聚合物干扰下游检测。
- （新兴方法）切向流过滤：
- 原理： 利用孔径选择性的滤膜，在切向流作用下实现目标尺寸EVs的快速富集和缓冲液置换。
- 优点： 适合处理大体积样本（如发酵液），可线性放大，操作相对温和。
- 缺点： 初期设备投入较高，膜污染可能导致效率下降。
三、胞外囊泡的鉴定与表征（核心检测）
需结合多种技术对分离得到的产物进行确认：
- 粒径分布与浓度分析（纳米颗粒追踪分析 - NTA）：
- 原理： 利用激光照射悬浮粒子产生的散射光，通过显微镜和相机追踪单个粒子的布朗运动，基于斯托克斯-爱因斯坦方程计算粒径和浓度。
- 应用： 测量发酵液来源EVs的粒径分布范围（典型在30-200 nm）和颗粒浓度。是判断分离效果和产量的重要指标。
- 优点： 提供单个颗粒信息，分辨率较高（尤其在<100 nm范围）。
- 动态光散射（DLS）：
- 原理： 测量溶液中粒子布朗运动导致的散射光强度波动，计算平均流体力学粒径（Z-average）和粒径分布（多分散指数PDI）。
- 应用： 快速评估EVs悬液的平均粒径和均一性。
- 优缺点： 速度快，操作简便，对样品浓度要求低；但对混合物分辨力差，易受大颗粒或聚集体的严重影响。
- 透射电子显微镜（TEM）形态学观察：
- 步骤： 通常将EVs样品滴加至载网膜上，负染（常用醋酸铀或磷钨酸）后在TEM下观察。
- 结果： 可直观看到典型的“杯状”或“双凹圆盘状”囊泡形态。是确认分离物具有囊泡状结构的关键证据。
- 要点： 制样过程（干燥、染色）可能导致形态改变，需谨慎解读。
- 囊泡特异性标志物检测（免疫印迹 - Western Blot）：
- 原理： 通过SDS-PAGE分离EVs裂解液中的蛋白质，转膜后使用特异性抗体检测EVs相关标志物。
- 常用标志物：
- 跨膜蛋白： Tetraspanins (CD9, CD63, CD81) - 普遍存在于多种EVs表面。
- 胞质蛋白： TSG101, Alix - 参与囊泡生物发生(MVB途径)。
- 阴性对照： 检测非EVs组分标志物（如Calnexin/GRP94（内质网）、Cytochrome C（线粒体）、Apolipoprotein B/A1（脂蛋白）），评估污染物水平。
- 意义： 确认富集物中存在典型的EVs相关蛋白，是EVs身份鉴定的分子生物学证据。
- 流式细胞术（高灵敏度纳米流式）：
- 原理： 利用特异性荧光标记抗体标记EVs表面抗原（如CD9, CD63），通过专用纳米流式细胞仪检测散射光和荧光信号。
- 优点： 可对单个EVs进行表型分析（计数特定亚群）。
- 挑战： 常规流式细胞仪检测下限（约300-500 nm）远大于多数EVs尺寸。专用纳米流式（检测下限<100 nm）是更优选择，但设备相对昂贵。
四、功能活性初步验证（可选但重要）
- 膜完整性检测：
- 原理： 利用膜不通透性染料（如SYTO RNA Select, 可结合核酸）和膜通透性染料（如SYTOX系列）。完整EVs仅被膜通透性染料染色（如果膜破损），或仅膜通透性染料能进入内部染色核酸（如果事先染色核酸）。
- 应用： 评估分离过程是否导致囊泡膜大量破裂。
- 细胞摄取实验：
- 步骤： 用亲脂性荧光染料（如DiI, PKH67）标记EVs膜，与特定受体细胞共孵育，通过荧光显微镜或流式细胞术观察荧光是否进入受体细胞。
- 意义： 初步验证发酵液来源EVs能被靶细胞识别和内化，提示其潜在功能活性。
五、数据分析与报告要点
- 全面表征： 报告EVs的浓度、粒径分布（NTA/DLS）、形态（TEM）、特异性标志物表达（WB）、非囊泡污染物标志物情况（WB）、纯度评估（如蛋白总量/颗粒数）。
- 方法细节： 清晰描述所有关键实验参数（离心力/时间、过滤孔径、缓冲液成分、抗体信息、仪器型号及设置）。
- 对照设置： 包括空白对照、阴性对照（如无EVs样品、非相关抗体）和阳性对照（如已知EVs标准品）。
- 结果解读： 需认识到单一方法均有局限性，结论应基于多种互补技术的综合结果。明确分离所得产物的主要成分是EVs，并尽可能说明其可能的亚群（如外泌体、微囊泡）。
总结：
发酵液中胞外囊泡的检测是一个系统工程，需遵循“前处理->分离富集->多维度表征”的流程。克服发酵液复杂基质的干扰是成功的关键，选择适当的分离方法（常需组合使用）并利用NTA、TEM、WB和纳米流式等技术进行严格表征，才能获得可靠结果。随着技术进步（如微流控芯片、新型亲和捕获材料、高分辨率质谱），发酵液EVs的研究将更加深入高效。