牛奶外泌体分离与检测技术流程
牛奶外泌体是牛乳腺上皮细胞分泌的纳米级囊泡（30-150 nm），富含蛋白质、核酸、脂质等功能性分子。其在营养传递、免疫调节及疾病诊断方面具有重要研究价值。以下为标准化分离与检测流程：
一、样品前处理
- 原料乳采集：无菌采集生鲜牛乳，4℃运输。
- 脱脂处理：
- 3,000 ×g 离心 30 min（4℃）
- 去除上层脂肪层及底层细胞碎片
- 保留中层脱脂乳
- 去除酪蛋白：
- 添加乙酸钠缓冲液（pH 4.5）沉淀酪蛋白
- 12,000 ×g 离心 40 min（4℃）
- 收集乳清上清液，0.22 μm 滤膜过滤
二、外泌体分离（核心方法）
方案A：差速超速离心法（金标准）
- 初步澄清：10,000 ×g 离心 45 min（4℃），去除大颗粒
- 超速离心富集：
- 100,000 ×g 超速离心 70 min（4℃）
- PBS重悬沉淀
- 重复离心 100,000 ×g × 70 min
- 沉淀保存：PBS重悬沉淀，-80℃保存
方案B：尺寸排阻色谱法（高纯度）
- 预处理乳清过SEC色谱柱（如Sepharose CL-4B）
- 收集含外泌体组分（依据洗脱时间/体积）
- PBS透析或超速离心浓缩
三、外泌体鉴定与表征
1. 形态学分析
- 透射电镜（TEM）：2%磷钨酸负染，观察典型杯状结构
- 纳米粒子追踪分析（NTA）：定量粒径分布（峰值应为80-120 nm）
2. 蛋白质标志物检测
- Western Blot：
- 阳性标志物：CD63、CD81、TSG101、Alix
- 牛奶特异性标志物：乳脂肪球膜蛋白（MFG-E8）
- 阴性对照：Calnexin（胞质蛋白）
- 质谱分析：全蛋白质组鉴定
3. 浓度与纯度评估
- BCA法/Bradford法：测定总蛋白浓度
- A280/A260比值：评估核酸污染（理想值>1.0）
四、质量控制要点
- 避免杂蛋白污染：超离前彻底去除酪蛋白
- 防止聚合体形成：分离过程添加蛋白酶抑制剂
- 低温操作：全程4℃维持囊泡完整性
- 多次PBS清洗：降低乳糖/盐分残留
五、核心应用方向
| 研究领域 | 应用价值 |
|---|---|
| 营养载体开发 | 包封活性物质，提升生物利用率 |
| 疾病标志物筛查 | 检测乳源致病微生物或宿主炎症因子 |
| 婴幼儿免疫调节 | 研究外泌体miRNA对肠道菌群的影响 |
| 乳品加工适应性 | 评估热处理对囊泡活性的影响 |
技术挑战与展望
- 标准化瓶颈：急需建立跨平台分离鉴定标准
- 功能机制研究：需结合动物模型验证递送路径
- 规模化生产：开发低成本、高回收率的分离技术
- 安全性评估：完善外泌体剂量效应数据库
该技术体系为乳源外泌体研究提供基础框架，推动其在食品科学、预防医学及生物载体领域的应用突破。未来研究需着重关注外泌体异质性解析及其跨物种调控机制。