保健食品体外增强人自然杀伤细胞（NK）对靶细胞杀伤功效的实验研究
摘要：
本研究旨在评估一种复合草本保健食品体外对人外周血自然杀伤细胞（NK细胞）杀伤活性的影响。采用健康人外周血分离单个核细胞（PBMCs），经IL-2刺激扩增富集NK细胞。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放法，测定不同浓度受试保健食品处理组、空白对照组及阳性对照组（干扰素α）中NK细胞对K562白血病细胞株的杀伤率。结果表明，受试保健食品在特定浓度范围内（125-500 μg/mL）能显著提升NK细胞对靶细胞的杀伤效率（p<0.05），最高提升幅度达35.2%，呈现剂量依赖性效应。阳性对照组干扰素α同样展现出显著的增强效果（p<0.01）。本研究证实该保健食品在体外具有增强人NK细胞抗肿瘤免疫活性的潜力，其机制可能与激活NK细胞活化性受体信号通路及促进效应分子释放相关。
关键词： 自然杀伤细胞（NK细胞）；细胞毒性；乳酸脱氢酶释放法；保健食品；免疫功能；K562细胞
1. 引言
自然杀伤细胞（NK细胞）作为固有免疫系统的关键效应细胞，在抗肿瘤、抗病毒免疫监视中发挥核心作用。其无需预先致敏即可识别并杀伤肿瘤细胞或病毒感染细胞的能力，使其成为维持机体健康的重要防线。NK细胞活性受多种内外因素影响，研究显示某些生物活性物质（如特定多糖、黄酮类化合物）可能通过调节受体表达或胞内信号传导增强NK细胞功能。保健食品作为潜在的免疫调节剂，其是否能有效、安全地提升NK细胞活性，是科学界与消费者共同关注的焦点。本研究采用体外实验模型，严谨评价一种复合草本来源保健食品对健康人NK细胞杀伤靶细胞能力的影响，为探讨其免疫调节机制提供实验依据。
2. 材料与方法
2.1 主要材料与试剂
- 受试样品： 复合草本保健食品粉末（主要含多糖、黄酮及皂苷类成分）。使用前经模拟胃肠道消化处理（胃蛋白酶pH2.0处理2h，胰酶pH7.5处理4h），离心取上清，冻干后溶于RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清，FBS）配制成所需浓度储备液，0.22μm滤膜除菌。
- 细胞系： 人慢性髓系白血病细胞株K562（典型NK细胞敏感靶细胞），购自中国典型培养物保藏中心。
- 实验细胞来源： 健康成人志愿者（n=5，签署知情同意书）捐献外周静脉血（经伦理委员会批准）。
- 主要试剂： 淋巴细胞分离液（美国Sigma公司），重组人白细胞介素-2（rhIL-2，美国PeproTech公司），干扰素α（阳性对照，美国R&D Systems公司），RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒（日本同仁公司）。
- 主要仪器： CO2恒温培养箱（美国Thermo公司），生物安全柜（德国贺利氏公司），低速离心机（美国Beckman公司），酶标仪（美国BioTek公司），倒置显微镜。
2.2 实验方法
-
2.2.1 PBMCs分离与NK细胞富集：
- 健康人外周血经肝素抗凝，用等体积PBS稀释。
- 将稀释血液小心叠加于等体积淋巴细胞分离液界面。
- 室温400g离心25分钟。
- 吸取界面白膜层（PBMCs），PBS洗涤3次。
- 细胞重悬于含rhIL-2（500 IU/mL）的RPMI-1640完全培养基中（含10% FBS，1%青霉素-链霉素），置于37℃，5% CO2培养箱中培养7天，隔天半量换液，以扩增和富集NK细胞（CD3-CD56+细胞比例流式检测>70%）。
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2.2.2 受试样品处理：
将富集培养第7天的NK细胞悬液离心收集，用新鲜不含IL-2的完全培养基重悬计数。实验分组如下：- 空白对照组： NK细胞 + 等体积培养基
- 阳性对照组： NK细胞 + 干扰素α（终浓度1000 IU/mL）
- 受试样品组： NK细胞 + 不同浓度受试保健食品上清液（终浓度分别为：62.5 μg/mL, 125 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL）
各组细胞调整浓度为1×10^6 cells/mL，按分组加入相应处理物，置于37℃, 5% CO2培养箱中孵育48小时。
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2.2.3 LDH释放法检测NK细胞杀伤活性：
- 靶细胞准备： K562细胞于对数生长期收集，用完全培养基洗涤后重悬至2×10^5 cells/mL。
- 效应细胞准备： 孵育48小时后的NK细胞离心收集，用新鲜不含FBS的培养基洗涤并重悬至所需浓度。
- 效靶比设置： 本实验选用效靶比（E:T）为10:1。
- 杀伤实验： 取96孔圆底培养板，每孔设置：
- 实验孔（E）： 效应细胞（NK）100μL + 靶细胞（K562）100μL
- 自发释放孔（Tsp）： 靶细胞100μL + 培养基100μL
- 最大释放孔（Tmax）： 靶细胞100μL + Lysis Solution（裂解液）100μL
- 效应细胞自发孔（Esp）： 效应细胞100μL + 培养基100μL
每组设3个复孔。
- 将培养板置于37℃，5% CO2培养箱中孵育4小时。
- 孵育结束，每孔吸取50μL上清液转移到新的96孔酶标板对应孔中。
- 按LDH试剂盒说明书，每孔加入50μL底物混合液，室温避光反应30分钟。
- 每孔加入50μL终止液终止反应。
- 用酶标仪在490nm（参考波长650nm）读取吸光度（OD）值。
- NK细胞杀伤率计算：
杀伤率 (%) = [(OD<sub>E</sub> - OD<sub>Esp</sub> - OD<sub>Tsp</sub>) / (OD<sub>Tmax</sub> - OD<sub>Tsp</sub>)] × 100%
OD<sub>E</sub>: 实验孔平均OD值；
OD<sub>Esp</sub>: 效应细胞自发释放孔平均OD值；
OD<sub>Tsp</sub>: 靶细胞自发释放孔平均OD值；
OD<sub>Tmax</sub>: 靶细胞最大释放孔平均OD值。
-
2.2.4 统计学分析：
实验数据以平均值±标准差（Mean ± SD）表示。采用SPSS 26.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以p < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
- 3.1 NK细胞杀伤活性比较：
如表1及图1所示，与空白对照组（杀伤率38.7±3.5%）相比，阳性对照组干扰素α能极显著地增强NK细胞对K562细胞的杀伤活性（杀伤率提高至58.9±4.2%，p < 0.01）。受试保健食品在实验浓度范围内对NK细胞活性均表现出增强作用，且在125 μg/mL、250 μg/mL和500 μg/mL浓度下，这种增强作用具有统计学显著性（p < 0.05），杀伤率分别达到44.8±2.9%、49.4±3.8%和53.9±4.1%。在最高浓度500 μg/mL时，增效幅度达到35.2%。作用效果呈现良好的剂量依赖性趋势（r=0.92）。62.5 μg/mL浓度组虽有提升趋势（40.1±3.2%），但未达到统计学显著水平（p > 0.05）。各浓度样品组均未观察到对NK细胞或靶细胞的显著毒性（Esp孔与Tsp孔OD值与对照组无显著差异）。
表1：不同处理组NK细胞对K562细胞的杀伤率（%，Mean ± SD, n=5）
| 组别 | 浓度 | NK细胞杀伤率 (%) | 与空白对照组比较 (p) |
|---|---|---|---|
| 空白对照组 | - | 38.7 ± 3.5 | - |
| 阳性对照组 | 1000 IU/mL | 58.9 ± 4.2 | < 0.01 |
| 受试样品组 | 62.5 μg/mL | 40.1 ± 3.2 | > 0.05 |
| 125 μg/mL | 44.8 ± 2.9 | < 0.05 | |
| 250 μg/mL | 49.4 ± 3.8 | < 0.05 | |
| 500 μg/mL | 53.9 ± 4.1 | < 0.05 |
图1：不同处理组NK细胞杀伤率柱状图（略）
4. 讨论
本研究通过体外LDH释放法，清晰证实了该复合草本保健食品在生理相关浓度下（125-500 μg/mL），能够有效促进经IL-2预激活的健康人NK细胞对K562白血病靶细胞的杀伤活性，且该效应呈现剂量依赖性。这一结果与阳性对照干扰素α的作用趋势一致，验证了实验体系的可靠性。
NK细胞杀伤靶细胞主要通过两条核心途径：1）释放穿孔素（perforin）和颗粒酶（granzymes）诱导靶细胞凋亡；2）通过膜表面FasL或TRAIL等分子介导死亡受体凋亡通路。研究表明，多种植物来源的生物活性成分（如真菌多糖、黄芪甲苷、人参皂苷等）可通过作用于NK细胞表面的模式识别受体（如TLRs、Dectin-1）或直接调节胞内信号分子（如MAPK, STATs），上调NK细胞活化性受体（如NKG2D, DNAM-1, NKp30/44/46）的表达，促进胞内细胞毒性颗粒合成、极化及脱颗粒释放效应分子（穿孔素、颗粒酶B），从而提高其溶细胞能力。该保健食品所含的复合多糖、黄酮及皂苷类物质极可能通过类似机制发挥作用。
本研究局限性在于：
- 体外模型限制： 体外实验环境简化，无法完全模拟体内复杂的免疫微环境（如细胞因子网络、免疫抑制性细胞、组织屏障等）及药代动力学过程。
- 样品处理： 虽采用模拟消化，但与体内复杂的胃肠消化吸收及肝脏首过效应仍有差异。
- 健康供体来源： 结果反映对健康人NK的作用，其对免疫功能低下个体NK细胞活性的影响需进一步研究。
- 机制未深入： 增强作用的具体分子靶点及信号通路尚待深入解析（如受体表达、穿孔素/颗粒酶表达水平测定）。
5. 结论
本实验研究结果表明，该草本复合保健食品在体外特定浓度范围内（125-500 μg/mL）能显著增强健康人外周血来源NK细胞对K562肿瘤靶细胞的杀伤活性，且效果随浓度增加而增强。这一作用提示该保健食品具有调节机体固有免疫功能、增强免疫监视作用的潜力。未来的研究应侧重于：1）利用动物模型验证其在体效果；2）在特定人群（如免疫低下者）中进行临床观察；3）深入探究其激活NK细胞的具体分子机制（如关键受体表达、效应分子分泌调控等），为其科学应用提供更坚实的理论基础。
利益冲突声明
作者声明不存在任何潜在的利益冲突。
伦理批准
涉及人体的血液样本采集已获得相关机构伦理委员会审查批准（批件号：XXX），所有志愿者均签署知情同意书。
致谢（略）
（此部分可根据实际情况添加对资助机构、提供技术支持或样本的合作单位或个人的感谢，但需遵循无企业名称要求）
请注意：
- 本文为模拟实验报告，数据基于典型实验结果模式设定，用于展示研究框架和方法。
- 实际研究中，所有试剂、设备、细胞来源需标明具体供应商信息（本文中仅以“美国Sigma公司”等示例代替，实际写作需写明真实厂商），但应避免在正文中提及受试样品相关的生产或销售企业名称。
- 严谨的科学实验需进行多次独立重复，并提供详细的原始数据记录和统计分析方法。
- 图1（柱状图） 在实际报告中需根据真实数据绘制并附上。