乳酸化修饰定量蛋白组

发布时间：2025-06-11 18:45:25 阅读量：5 作者：生物检测中心
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乳酸化修饰定量蛋白质组学：解码代谢调控的新维度

蛋白质的翻译后修饰（PTM）是调控其功能的核心机制。近年来，乳酸化修饰（Lactylation，简写为Kla）的发现，为理解细胞如何在代谢与基因表达、免疫应答、疾病发生等生命活动间架起桥梁开辟了全新视角。乳酸化修饰定量蛋白质组学技术，作为深入研究这一动态修饰的关键工具，正推动生命科学前沿探索。

一、 乳酸化修饰：代谢与表观遗传的交汇点

乳酸化修饰是指乳酸分子通过酯键共价连接在蛋白质赖氨酸残基（Lysine）ε-氨基上的过程。其核心特征包括：

  • 代谢物驱动： 核心底物乳酸是糖酵解的主要终产物之一，将细胞能量状态（如Warburg效应）与蛋白质功能直接关联。
  • 表观遗传调控： 组蛋白上的乳酸化修饰（如H3K18la）被证实能松弛染色质结构，激活特定基因（如M2型巨噬细胞标志物Arg1）的转录，是连接细胞代谢与表观基因组的关键桥梁。
  • 广泛非组蛋白靶标： 除组蛋白外，大量非组蛋白被发现存在乳酸化修饰，涉及代谢酶、信号转导蛋白、转录因子、细胞骨架蛋白等，表明其对细胞生理病理过程具有全局性调控潜力。
  • 动态可逆性： 组蛋白去乳酸化酶（如HDAC1, HDAC3, SIRT1-SIRT3）的发现证实乳酸化修饰受到精确的“书写器”（如丙酮酸脱氢酶复合物成员PDHA2被推测可能参与，TET2也被报道具有乳酸转移酶活性）和“擦除器”调控，其水平随微环境（如乳酸浓度、缺氧、炎症刺激）变化而快速响应。

二、 乳酸化修饰定量蛋白质组学的核心技术流程

精准绘制乳酸化修饰图谱并实现定量分析，是揭示其生物学意义的基础。其核心技术流程整合了富集、质谱与生物信息学：

  1. 样本制备与蛋白质提取：

    • 根据研究目标选择合适的细胞、组织或体液样本。
    • 使用裂解缓冲液（通常含蛋白酶抑制剂、去乳酸化酶抑制剂）提取总蛋白。
    • 蛋白质经还原、烷基化后，使用特异性蛋白酶（如胰蛋白酶）酶解成肽段混合物。

  2. 乳酸化修饰肽段的特异性富集（关键步骤）：

    • 这是成功鉴定的核心瓶颈。目前主要依赖针对乳酸化赖氨酸残基的特异性抗体进行免疫亲和富集（IP）。
    • 富集效率和质量高度依赖于抗体的特异性、亲和力及优化实验条件（如洗脱缓冲液pH）。优化富集策略是提高覆盖深度和可靠性的关键。

  3. 液相色谱-质谱联用分析（LC-MS/MS）：

    • 富集后的肽段通过高效液相色谱（HPLC/NanoLC）分离。
    • 分离后的肽段进入高分辨率、高灵敏度的质谱仪（如轨道阱Orbitrap系列、飞行时间TOF系列）进行检测。
    • 质谱采集模式：采用数据依赖型采集（DDA）或数据非依赖型采集（DIA）。DIA模式因其重现性好、定量更准确，在复杂修饰组定量分析中更具优势。

  4. 质谱数据分析与位点鉴定定量：

    • 原始质谱数据使用专业软件（如MaxQuant, Proteome Discoverer, Spectronaut等）进行搜库分析。
    • 数据库搜索需包含乳酸化修饰（常用delta mass = +72.021129 Da）作为可变修饰，并设置严格的搜库参数与过滤标准（如假发现率FDR ≤ 1%）。
    • 定量策略：
      • 标记定量： 如TMT/iTRAQ（体外标记）、SILAC（体内代谢标记）。允许多组样本同时上机分析，减少批次效应，提高通量和定量精度。
      • 非标记定量（LFQ）： 基于肽段离子流色谱峰强度或谱图计数进行相对定量。操作相对简单，成本较低，适用于样本量较大的研究，但对实验重现性要求高。
      • 绝对定量： 通常需要合成同位素标记的重肽段（AQUA, PRM）作为内标。

  5. 生物信息学分析：

    • 功能注释： 对鉴定到的乳酸化蛋白进行基因本体（GO）分析（生物过程、分子功能、细胞定位）、KEGG/Reactome通路富集分析，揭示乳酸化修饰调控的核心生物学过程。
    • 蛋白互作网络： 构建乳酸化修饰蛋白质的相互作用网络（PPI），识别关键枢纽蛋白和模块。
    • 结构域与基序分析： 挖掘乳酸化修饰位点邻近的特征性氨基酸序列基序（Motif），推测潜在的识别或调控机制。
    • 多组学整合： 将乳酸化修饰数据与转录组、代谢组、乙酰化修饰组等其他组学数据关联分析，构建更全面的调控网络。

三、 技术挑战与前沿进展

乳酸化修饰定量蛋白质组学面临的主要挑战及应对策略：

  • 抗体依赖性与低丰度： 乳酸化修饰丰度通常较低，且高度依赖抗体富集。抗体质量差异是覆盖深度和重复性的主要限制因素。对策：持续开发高特异性、高亲和力抗体；探索基于化学生物学的替代富集方法（如开发乳酸化多肽模拟物配基）。
  • 精确位点指认： 赖氨酸残基上可能存在多种PTM（乙酰化、琥珀酰化、巴豆酰化等），其精确分子量差异极小（如乙酰化+42.010565 Da，乳酸化+72.021129 Da），对质谱分辨率、精度及数据分析算法构成挑战。对策：使用超高分辨率质谱（如Orbitrap Exploris 480等）；优化碎裂模式（如ETD/ECD有助于保留修饰）；开发更强大的修饰位点定位算法。
  • 定量准确性： 修饰肽段的低丰度和电离效率差异影响定量准确性。对策：采用标记定量法（尤其DIA模式）提高重现性；优化富集和LC分离条件；结合靶向质谱（PRM/MRM）验证关键位点。
  • 动态范围： 组织样本中蛋白丰度差异巨大，低丰度乳酸化蛋白易被掩盖。对策：精细分级（细胞器分离、强阳离子交换色谱SCX等）；深度分级富集。
  • 体内调控机制解析： 区分“驱动者”与“乘客”修饰。对策：结合功能实验（如位点突变、酶活性调控、CRISPR筛选）验证关键乳酸化修饰的功能；进行时间序列或剂量依赖刺激的动态分析。

四、 生物学应用与重大发现

该技术已在多个领域揭示乳酸化修饰的关键作用：

  1. 肿瘤发生与微环境：

    • 肿瘤细胞高糖酵解产生大量乳酸，驱动肿瘤微环境中（包括肿瘤细胞自身及浸润免疫细胞）广泛的乳酸化修饰。
    • 例如，肿瘤细胞中HIF-1α的乳酸化促进其稳定性及促癌转录活性；PKM2乳酸化影响其代谢酶活性及核功能；肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中关键转录因子的乳酸化促进其向免疫抑制性M2表型极化，抑制抗肿瘤免疫。

  2. 免疫调控与炎症：

    • 巨噬细胞极化：M2型巨噬细胞活化时，乳酸累积驱动组蛋白（如H3K18la）和关键转录因子（如STAT3）的乳酸化，促进抗炎因子（如Arg1, VEGF）表达，是其维持抗炎表型的重要机制。
    • 其它免疫细胞：乳酸化也调控树突状细胞、T细胞的功能。

  3. 神经系统疾病：

    • 神经兴奋或病理条件下，乳酸水平变化影响神经元和胶质细胞功能蛋白的乳酸化状态。
    • 例如，亨廷顿病相关蛋白Huntingtin（HTT）的乳酸化修饰被发现影响其聚集和毒性。

  4. 感染与宿主应答：

    • 病原体感染可改变宿主细胞的代谢状态和乳酸水平，进而重塑乳酸化修饰景观。
    • 宿主蛋白的乳酸化可能参与调控抗病毒免疫应答（如cGAS-STING通路）或病原体的。

  5. 代谢性疾病：

    • 在肥胖、糖尿病等代谢紊乱状态下，组织乳酸水平异常可能通过乳酸化修饰影响胰岛素信号通路关键蛋白、肝脏糖脂代谢酶等的功能。

五、 未来展望

乳酸化修饰定量蛋白质组学正处于快速发展阶段，未来重点方向包括：

  • 技术创新： 开发更高效、特异的非抗体依赖富集方法；提升超高灵敏度质谱和DIA技术；发展更精准的位点定位与绝对定量方案。
  • 覆盖深度与动态分析： 实现单细胞水平或亚细胞空间分辨的乳酸化修饰分析；精细描绘修饰在时间尺度（如细胞周期、发育、疾病进程）上的动态变化。
  • 机制深度解析： 系统性鉴定“书写器”与“擦除器”酶；阐明乳酸化修饰如何特异调控底物蛋白的结构、相互作用、定位及活性；探索其与其他PTM（如乙酰化、磷酸化）的“交叉对话”。
  • 转化医学研究： 深入挖掘乳酸化修饰在重大疾病（如癌症、自身免疫病、神经退行性疾病）中的诊断、预后标志物价值；探索靶向关键乳酸化修饰酶或调控网络的创新治疗策略。

结论：

乳酸化修饰定量蛋白质组学是破解“乳酸信号”生物学密码的核心利器。随着技术的持续突破和应用的不断深入，它将为我们绘制更精细的乳酸化修饰动态图谱，深刻揭示其在生理稳态维持和疾病发生发展中的关键调控作用，最终为理解生命复杂性和开发新型诊疗手段提供革命性的见解。这一领域的发展，标志着我们从单纯关注代谢物浓度，深入到解析代谢物介导的蛋白质功能调控网络的新时代。