iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组学技术详解
技术原理 同位素标记相对与绝对定量技术（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ）及串联质谱标签（Tandem Mass Tags, TMT）是两种核心的多重蛋白质定量技术。其核心在于使用具有相同总质量但报告基团质量不同的同重同位素标签，通过化学标记实现多重样本的同步分析。
- 同重设计： 所有标签在未碎裂时总质量完全相同（如TMT 10-plex各标签均为304.207 Da），一级质谱中表现为单一峰。
- 报告离子释放： 在串联质谱（MS/MS或MS³）碎裂过程中，标签释放出质量差异固定的报告离子（如TMT 10-plex报告离子质量差为6.32 mDa）。
- 相对定量： 通过比较不同样本来源肽段释放的报告离子强度，实现多个样本间蛋白质表达量的相对定量。
实验流程
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样本制备：
- 提取细胞/组织总蛋白
- 蛋白质变性、还原及烷基化
- 胰蛋白酶酶解生成肽段混合物
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标记反应：
- 不同样本来源的肽段分别与特定通道的iTRAQ/TMT标签反应
- 反应通过伯胺基团（肽段N端及赖氨酸侧链）进行共价结合
- 淬灭未反应的标签
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样本混合：
- 将标记后的所有样本等量混合成单一复合样本
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色谱分离：
- 混合肽段经高效液相色谱（HPLC）分离（常使用C18反相柱）
- 梯度洗脱实现肽段复杂混合物的分离
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质谱分析：
- 一级质谱（MS1）扫描检测肽段母离子
- 选择母离子进行碎裂（CID/HCD）
- 二级质谱（MS2）检测报告离子及肽段碎片
- （可选）MS³分析提高定量准确性
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数据分析：
- 数据库搜索鉴定肽段/蛋白质（如使用Mascot、MaxQuant等）
- 提取报告离子强度进行相对定量
- 统计学分析筛选差异表达蛋白质
- 生物信息学分析（功能注释、通路富集等）
技术优势
- 高通量并行： 单次实验可同时比较2-16个样本（如TMTpro 16-plex）
- 系统误差降低： 所有样本在质谱检测前完成混合，减少预处理偏差
- 覆盖深度： 可鉴定数千种蛋白质，覆盖中高丰度蛋白组
- 样本兼容性： 适用于细胞、组织、体液等多种样本类型
- 动态范围： 通过分级分离提高低丰度蛋白检出率
技术挑战与应对策略
- 共洗脱肽段干扰（Ratio Compression）：
- 原因： 杂质肽段干扰报告离子信号
- 解决方案： 采用MS³扫描（如SPS-MS3）或色谱优化
- **标记效率差异：
- 应对策略： 严格质量控制，平衡标记反应条件
- 批次效应：
- 应对策略： 实验设计包含内参样本或跨批次校正
- **数据分析复杂性：
- 应对策略： 采用专用分析软件（如Proteome Discoverer, FragPipe）
典型应用场景
- 生物标志物发现：
- 疾病组与对照组血清/组织蛋白质组差异分析
- 肿瘤分型及治疗反应预测标志物筛选
- 药物机制研究：
- 药物处理前后细胞蛋白质动态变化
- 药物靶点及脱靶效应鉴定
- 信号通路解析：
- 生长因子刺激后磷酸化蛋白质组时程变化
- 基因敲除/过表达模型通路扰动研究
- 发育与分化研究：
- 干细胞分化不同阶段蛋白质表达谱
- 胚胎发育关键节点蛋白质网络重构
- 植物抗逆机制：
- 干旱/盐胁迫下植物蛋白质应答网络
- 病原菌侵染宿主蛋白质组互作研究
技术发展前沿
- 超高通量： TMTpro 16-plex实现16样本同步分析
- 高灵敏度： 微流控色谱与新型质谱仪提升低起始量样本检出
- 空间分辨率： 结合激光捕获显微切割（LCM）实现组织区域特异性分析
- 多组学整合： 与转录组、代谢组数据联合分析
- 单细胞应用： 基于载体标记的单细胞蛋白质组学探索（如SCoPE-MS）
与其他定量技术比较
总结 iTRAQ/TMT技术凭借其独特的多重定量能力，已成为蛋白质组学研究的核心工具。随着质谱硬件、标记试剂及分析算法的持续革新，该技术正在向更高通量、更高灵敏度的方向发展。研究者需深入理解其技术原理与局限，通过严谨的实验设计和数据分析策略，充分挖掘其在生命科学研究及临床转化中的巨大潜力。
本技术详解严格遵循学术中立原则，聚焦技术原理与方法学，未涉及任何商业实体信息，适用于学术研究参考及实验方案设计。