双缩脲法蛋白定量检测技术详解
一、方法原理
双缩脲法（Biuret Method）是一种基于蛋白质肽键结构的经典比色定量分析技术。其核心原理是：
- 肽键反应： 在强碱性环境（通常由氢氧化钠提供）中，蛋白质分子中的多个肽键（-CO-NH-）能与二价铜离子（Cu²⁺）发生特异性络合反应。
- 紫色复合物形成： 该络合反应生成一种稳定的、在可见光区有强烈吸收的紫红色络合物（最大吸收波长通常在540-560 nm附近）。
- 定量基础： 在一定浓度范围内（通常为1-10 mg/mL蛋白质），生成的紫红色络合物的浓度（即其吸光度）与参与反应的蛋白质浓度成正比。通过测定反应液在特定波长（如540 nm或550 nm）下的吸光度，并与已知浓度的标准蛋白质溶液进行比较，即可计算出待测样品中的蛋白质含量。
二、主要特点与适用范围
- 优点：
- 操作简便快捷： 反应迅速，操作步骤相对简单，易于掌握。
- 稳定性好： 形成的紫红色络合物颜色稳定，不易受时间影响（通常在反应后30分钟内保持稳定）。
- 干扰相对较少： 对蛋白质种类的特异性要求不高，不同蛋白质（只要含有两个或以上肽键）产生的颜色强度相似度较好，尤其适用于混合蛋白质样品的测定。
- 试剂成本低： 所用试剂均为常见化学品，成本低廉。
- 缺点：
- 灵敏度较低： 检测下限通常在毫克每毫升（mg/mL）级别，远低于BCA法或Lowry法（微克每毫升级别），不适用于低浓度蛋白质样品。
- 特异性限制： 虽然对蛋白质种类特异性不高，但任何能与Cu²⁺在碱性条件下产生类似颜色反应的物质（如某些含氮化合物、某些缓冲液成分）都可能构成干扰。
- 线性范围有限： 最佳线性范围通常为1-10 mg/mL，超出此范围需稀释或浓缩样品。
- 适用范围：
- 适用于相对高浓度（mg/mL级）蛋白质溶液的快速定量分析。
- 常用于血清、组织匀浆液、蛋白质纯化过程中的粗提液等样品的蛋白质含量测定。
- 特别适合于对灵敏度要求不高，但需要快速、稳定、低成本检测的场景。
三、试剂配制（重要提示：使用分析纯试剂与去离子水）
- 双缩脲试剂（核心试剂）：
- 组分：
- 硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）：1.50 g
- 酒石酸钾钠（KNaC₄H₄O₆·4H₂O）：6.00 g （作为络合剂稳定铜离子，防止氢氧化铜沉淀）
- 碘化钾（KI）：0.50 g （可选，有助于防止二价铜的自发还原）
- 氢氧化钠（NaOH）：10.00 g （提供强碱性环境）
- 去离子水：定容至500 mL
- 配制步骤：
- 将硫酸铜、酒石酸钾钠和碘化钾（若使用）溶解于约200 mL去离子水中。
- 在另一容器中，将氢氧化钠溶解于约200 mL去离子水中。
- 在搅拌下，将氢氧化钠溶液缓慢倒入硫酸铜-酒石酸钾钠溶液中。
- 用去离子水定容至500 mL，混合均匀。
- 储存于聚乙烯塑料瓶中（避免与玻璃反应），室温避光保存。此溶液应为深蓝色。若出现沉淀或颜色变化应重新配制。
- 组分：
- 蛋白质标准溶液：
- 常用牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白。
- 精确称取适量标准蛋白，溶解于合适的缓冲液（如生理盐水或样品缓冲液）中，配制成浓度精确的储备液（如10 mg/mL）。
- 临用前用相同缓冲液稀释，制备一系列已知浓度的标准工作液（例如：0, 2, 4, 6, 8, 10 mg/mL）。
- 待测样品溶液：
- 样品需溶解或稀释在适当的缓冲液中（与标准品所用缓冲液一致）。
- 样品的预估蛋白浓度应调整到标准曲线的线性范围内（1-10 mg/mL），通常需要预实验确定稀释倍数。
四、操作步骤（示例）
- 设置反应管： 取一系列洁净干燥的试管（如10 mL或15 mL规格），按以下分组标记：
- 空白管 (Blank)： 标准曲线零点。
- 标准管 (Standard)： 一系列不同浓度的标准蛋白溶液。
- 样品管 (Sample)： 待测样品溶液。
- 加液：
- 向空白管中加入与标准品/样品所用缓冲液等体积的缓冲液（通常0.5 mL或1.0 mL）。
- 向各标准管中加入相应浓度的标准蛋白工作液（体积与空白管缓冲液体积相同）。
- 向各样品管中加入待测样品溶液（体积与空白管缓冲液体积相同）。
- 加入双缩脲试剂：
- 向每支试管（包括空白管）中加入4倍体积的双缩脲试剂（例如，若样品/标准液体积为1 mL，则加入4 mL双缩脲试剂）。
- 关键： 确保所有管中加入的试剂体积一致。
- 混匀与反应：
- 立即充分混匀各管内容物（可用涡旋振荡器或反复倒置）。
- 室温下（20-25°C）静置反应30分钟。颜色应在5-10分钟内达到稳定，30分钟是常用的充分反应时间。
- 比色测定：
- 将反应液倒入比色皿中（确保比色皿洁净透明）。
- 使用可见光分光光度计，在540 nm或550 nm波长下测定各管的吸光度（A）。
- 调零： 用空白管反应液（即缓冲液+双缩脲试剂）作为参比调零。
五、数据处理与结果计算
- 绘制标准曲线：
- 以标准蛋白溶液的浓度（mg/mL）为横坐标（X轴）。
- 以对应的吸光度值（A）为纵坐标（Y轴）。
- 在坐标纸上描点，绘制标准曲线。理想情况下，各点应近似成一条直线（线性关系）。可使用最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程：
A = k * C + b，其中A为吸光度，C为浓度（mg/mL），k为斜率，b为截距。
- 计算样品蛋白浓度：
- 根据测得的样品管吸光度（A_sample），代入标准曲线方程中计算浓度（C_sample）。
- 公式：
C_sample = (A_sample - b) / k - 考虑稀释因素： 如果待测样品在检测前进行了稀释，则最终蛋白浓度需乘以相应的稀释倍数（D）。
- 最终浓度 = C_sample * D (mg/mL)
- 报告单位： 结果通常以毫克每毫升（mg/mL）或根据后续需求换算（如微克/微升 μg/μL，或总量 mg）。
六、关键注意事项与常见问题
- 试剂质量与稳定性： 使用高纯度试剂和去离子水。双缩脲试剂应新鲜配制（或确认未变质）且避光保存。变质的试剂（如出现沉淀或颜色异常）会导致结果不准确。
- 反应体积比： 严格保持样品/标准液体积与双缩脲试剂体积的比例（通常1:4）。比例改变会影响颜色强度和线性。
- 反应时间与温度： 确保所有样品在相同温度和反应时间下进行测定。温度波动会影响反应速率和颜色强度。
- 混匀充分： 加试剂后必须立即充分混匀，否则反应不均匀，颜色不稳定。
- 比色要求： 比色皿需洁净无划痕。在最大吸收波长（通常540或550 nm）附近测定。确保吸光度值落在标准曲线的线性范围内（避免过低或过高）。
- 干扰物质：
- 铵盐： 高浓度的铵离子（如来自硫酸铵沉淀）会严重干扰反应（与Cu²⁺结合形成深蓝色络合物），需通过透析或超滤去除。
- Tris、甘氨酸、EDTA等缓冲液： 某些缓冲成分在高浓度下可能干扰，尽量使用低浓度或换成兼容缓冲液（如磷酸盐缓冲液）。
- 脂类、核酸、糖类： 一般干扰较小，但在极高浓度下可能有影响。
- 含硫基化合物： 如巯基乙醇、DTT等强还原剂，会将Cu²⁺还原为Cu⁺，导致颜色异常（如变黄或不显色），需去除或氧化处理。
- 怀疑有干扰时，应做样品加标回收率实验评估。
- 线性范围： 严格遵守方法的线性范围（1-10 mg/mL）。样品浓度过高需稀释后重测；过低则需选用更灵敏的方法（如BCA法）。
- 标准品选择： 尽量选择与待测样品性质相似的蛋白质作为标准品（如测血清用BSA）。不同蛋白质在双缩脲反应中的显色强度略有差异（但通常小于其他方法如Lowry法）。
七、总结
双缩脲法作为一种历史悠久的蛋白质定量方法，凭借其操作简便、成本低廉、稳定性好和抗干扰能力相对较强（对蛋白质种类）等优点，在需要快速测定较高浓度蛋白质的应用场景中（如生化实验教学、临床血清蛋白分析、蛋白质纯化流程监控）仍具有重要价值。然而，其较低的灵敏度限制了其在微量蛋白分析中的应用。使用者需充分理解其原理、掌握操作细节、注意潜在干扰并正确进行数据处理，才能获得可靠的结果。当面对低浓度样品或存在严重干扰物时，应考虑选用BCA法、Bradford法或Lowry法等灵敏度更高的替代方法。
（注：本文仅提供通用技术信息，具体实验方案应根据实验室条件和样品特性进行调整优化。）