荧光原位杂交

发布时间：2025-07-24 20:51:14 阅读量：1 作者：生物检测中心

荧光原位杂交技术详解

荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）是一种强大的分子细胞遗传学技术，它利用荧光标记的特异性核酸探针，直接在细胞核、染色体或组织切片上定位和检测特定DNA或RNA序列的存在、位置、数量和结构变化。该技术在生物医学研究、临床诊断和遗传学领域发挥着关键作用。

一、 基本原理

FISH的核心原理是核酸互补杂交：

  1. 探针设计与标记： 合成或克隆与目标核酸序列互补的单链DNA或RNA片段（探针），并通过化学或酶学方法在其上标记荧光染料分子（如FITC、Cy3、Cy5、Texas Red等）。
  2. 杂交反应： 将标记好的探针与经过适当处理的细胞或染色体样本（如中期染色体铺片、间期细胞核悬滴片、石蜡包埋组织切片）混合。在严格控制的条件下（温度、pH、盐浓度、甲酰胺浓度），探针能够突破细胞结构的障碍，与样本中变性的（单链）目标DNA或RNA序列通过碱基互补配对原则（A-T/U, G-C）特异性结合（杂交）。
  3. 洗涤与信号检测： 洗脱掉未结合和非特异性结合的探针后，样本中仅留下特异结合在目标位点上的荧光探针。
  4. 荧光显微成像： 在荧光显微镜下，使用特定波长的激发光照射样本，探针上的荧光染料被激发，发射出特定波长的荧光信号。通过相应的滤光片系统，可以观察到目标序列在细胞内或染色体上的精确定位。不同颜色的荧光染料可同时用于标记不同的探针，实现多位点的同步检测（多色FISH）。
 

二、 主要实验流程（概述）

  1. 样本制备： 根据样本类型（血液、骨髓、新鲜组织、石蜡切片、培养细胞、染色体悬液等）进行固定、通透处理，使探针能接触到目标核酸。
  2. 变性： 样本和探针溶液通常需要分别或共同加热变性（如73-75°C），使双链DNA解旋成单链。
  3. 杂交： 将变性的探针溶液加到处理好的样本上，置于湿盒中（防止干燥），在特定温度（通常37-42°C）下孵育数小时至过夜，使探针与目标序列充分杂交。
  4. 洗涤： 使用不同严格度的洗涤液去除未结合的探针，减少背景信号。
  5. 复染与封片： 用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）、PI（碘化丙啶）等染料对细胞核或染色体进行染色（蓝色荧光），提供形态学参照。滴加抗淬灭封片剂，盖上盖玻片。
  6. 显微镜观察与分析： 在配备合适光源和滤光片的荧光显微镜下观察杂交信号。计数信号数量、观察信号位置、融合情况或分离情况等，并进行图像捕获和专业软件分析。
 

三、 技术特点与优势

  1. 高灵敏度和特异性： 能检测单拷贝基因序列、微小缺失/扩增、点突变（需特殊探针设计）。
  2. 高分辨率与直接可视化： 可在亚显微乃至分子水平上直观显示目标序列在染色体或细胞核内的精确位置（物理定位），分辨率可达1-2 Mb（中期染色体）或100 kb（间期核）。能看到染色体结构畸变（如易位、倒位、插入）的具体断裂点。
  3. 多色检测能力： 可同时使用多种不同颜色荧光标记的探针，实现多靶序列的同步检测和相互位置关系的分析（如多重FISH, mFISH; Spectral Karyotyping, SKY）。
  4. 不依赖细胞培养： 尤其适用于间期细胞（如血液、尿液、脱落细胞、实体瘤组织），大大缩短检测周期（数小时至数天）。
  5. 适用于存档样本： 可用于石蜡包埋的组织样本（FFPE），进行回顾性研究。
  6. 定量分析： 可用于基因拷贝数变化的定量分析（如比较基因组杂交FISH, CGH-FISH）。
 

四、 主要应用领域

  1. 医学遗传学与产前诊断：
    • 染色体数目异常筛查（如非整倍体：21三体、18三体、13三体、性染色体异常）。
    • 识别染色体微缺失/微重复综合征（如DiGeorge综合征/22q11.2缺失、Williams综合征/7q11.23缺失、Prader-Willi/Angelman综合征/15q11-13缺失）。
    • 检测染色体结构畸变（平衡/非平衡易位、倒位、环状染色体、标记染色体的来源鉴定）。
  2. 肿瘤学诊断与研究：
    • 辅助肿瘤分型、诊断和预后判断（如HER2基因扩增状态检测指导乳腺癌靶向治疗、BCR-ABL融合基因检测诊断慢性粒细胞白血病、MYC、CCND1等基因扩增检测）。
    • 检测肿瘤相关的特异性染色体易位（如尤文肉瘤的EWSR1易位、滑膜肉瘤的SS18-SSX易位、ALK融合基因检测等）。
    • 监测微小残留病（MRD）。
    • 分析肿瘤的染色体不稳定性（异倍性）。
  3. 微生物学与病原体检测：
    • 在组织或细胞样本中快速鉴定和定位特定病原体（如细菌、病毒）。
  4. 基础生物学研究：
    • 基因物理定位与染色体作图。
    • 研究基因组结构和功能（如基因座在细胞核内的空间排列、染色体领地）。
    • 分析端粒长度和结构变化（端粒FISH）。
    • 研究基因组不稳定性和DNA损伤修复。
    • 研究基因表达（RNA FISH检测特定mRNA在细胞内的分布）。
 

五、 FISH结果示例图示描述

  • 图A（正常二倍体间期细胞核）： 两个清晰的绿色信号点（代表特定基因座或着丝粒探针），均匀分布在经DAPI染成蓝色的细胞核内。
  • 图B（染色体易位中期分裂相）： 两条非同源染色体呈现出异常的颜色模式：一条染色体一端为红色荧光，另一端为绿色；另一条染色体一端为绿色荧光，另一端为红色。这是典型的双色双融合探针检测到的平衡易位（如BCR-ABL融合），两个红色信号、两个绿色信号和两个黄色（红绿重叠）融合信号。
  • 图C（基因扩增）： 间期细胞核内可见大量聚集的红色信号点（如HER2基因扩增），远超过正常的两个拷贝。
  • 图D（微缺失）： 间期细胞核内仅观察到一个绿色信号点（特定基因座探针），而同源区域对照探针（红色）显示有两个信号，表明存在一个等位基因的缺失。
 

总结

荧光原位杂交（FISH）凭借其直观可视化、高灵敏度、高特异性、多色检测能力以及对非分裂期细胞和存档样本的良好适用性，已成为现代医学遗传学诊断（尤其是染色体微缺失综合征）、肿瘤分子病理学精准诊断以及基础基因组研究中不可或缺的核心技术。随着探针设计优化、自动化操作平台发展和图像分析技术的进步，FISH的应用范围和研究深度仍在不断拓展，持续为人类理解基因组奥秘和提升疾病诊疗水平提供强大支持。