流式细胞分选：精确定格生命微观世界的“细胞分选师”
流式细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS），是基于流式细胞术原理发展起来的一项强大生物技术。它不仅能高速、多参数地分析细胞或微粒的物理和生化特性，更能根据预设标准，精准地将目标群体从复杂的混合样本中分离出来，为后续深入研究提供高纯度、高活性的目标细胞。
核心原理：光、电与微滴的精确操控
- 液流聚焦与单细胞化： 样本细胞悬液在鞘液的包裹和液压作用下，通过流动室形成极细的液流，确保细胞单列通过检测点。
- 激光激发与信号采集： 单列细胞依次通过一束或多束特定波长的激光束。细胞受到激发：
- 散射光： 前向散射光（FSC）反映细胞大小和相对粒度；侧向散射光（SSC）反映细胞内部复杂度（如颗粒、核型）。
- 荧光信号： 细胞若标记了荧光染料（如荧光抗体、荧光蛋白、活性染料、DNA染料等），被激光激发后会发射特定波长的荧光。这些光信号被一系列光电检测器（如光电倍增管PMT或光电二极管APD）接收并转化为电信号。
- 信号分析与门控决策： 仪器强大的计算机系统实时分析每个细胞产生的所有光信号（FSC, SSC，多个荧光通道）。实验人员预先设定好“门”（Gates），即基于这些参数组合的逻辑判断规则（例如，FSC中等、SSC中等、CD3阳性、CD4阳性、CD8阴性）。当细胞通过检测点时，系统瞬间判断其特性是否符合目标门控标准。
- 液滴形成与带电：
- 流动室出口处，液流在高频压电晶体产生的振动下断裂成均匀的微小液滴。理想情况下，每个液滴包裹一个细胞或无细胞。
- 在液滴即将形成的关键时刻，流动室内的液流会根据当前检测细胞的“判决结果”，瞬时带上正电荷、负电荷或不带电。
- 电场偏转与分选收集： 带电液滴在通过一对带恒定高压（一正一负）的偏转板时，受到电场力的作用发生偏转：
- 带正电荷的液滴偏向负极板方向。
- 带负电荷的液滴偏向正极板方向。
- 不带电的液滴垂直落下进入废液收集管。
- 通过精确控制液滴断裂时机和所带电荷，符合目标1标准的细胞被分选到收集管1，符合目标2标准的细胞进入收集管2，依此类推（通常为2路或4路分选）。
技术优势：
- 高特异性与高纯度： 基于多个散射光和荧光参数进行多重逻辑门控，可精确区分和分离目标细胞亚群，获得高纯度（通常>95%，甚至>99%）的分选产物。
- 高速高效： 现代分选仪每秒可分析数万个细胞，并根据设定分选数千至上万个细胞，适合处理大量样本或获取稀有的细胞群体。
- 多参数分析： 可同时检测多达数十个参数（受仪器荧光检测通道限制），实现对细胞特性的全面刻画。
- 高细胞活性： 优化后的分选条件和鞘液成分（如使用无菌PBS或培养基）能最大程度保持分选后细胞的活力，适用于下游培养、功能实验或移植。
- 物理隔离： 直接将目标细胞从异质性群体中分离出来，极大简化了下游实验。
- 单细胞精度： 理想情况下确保每个液滴只含一个细胞，可进行单细胞分选，应用于单细胞测序、克隆培养等。
核心应用领域：
- 免疫学研究：
- 分离特定免疫细胞亚群（如T细胞亚群：CD4+/CD8+ T细胞、调节性T细胞、记忆T细胞；B细胞亚群；树突状细胞；NK细胞等）。
- 研究细胞表面分子表达谱、细胞因子分泌、增殖状态、活化状态、信号通路激活等。
- 分选抗原特异性T细胞或B细胞。
- 干细胞研究：
- 分离造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞及其特定分化阶段的细胞。
- 纯化干细胞用于移植、体外扩增或定向分化研究。
- 肿瘤学研究：
- 分离循环肿瘤细胞、肿瘤干细胞、肿瘤浸润淋巴细胞。
- 分析肿瘤细胞异质性（DNA含量、增殖指数、特定标志物表达）。
- 分选特定细胞用于异种移植、药物敏感性测试或分子机制研究。
- 基因组学与转录组学：
- 单细胞分选后进行单细胞RNA测序、单细胞ATAC测序等，解析细胞异质性。
- 分选特定细胞类型构建文库，降低背景噪音。
- 细胞系开发与克隆筛选：
- 分选表达特定报告基因（如GFP、RFP）或经过基因编辑（如CRISPR）的单细胞用于建立稳定细胞株。
- 筛选高产目标蛋白的细胞克隆。
- 微生物学研究：
- 分选环境中或样本中的特定细菌、真菌或其他微生物。
- 研究微生物的生理状态（如活性/非活性）、群落结构。
- 染色体分选： 制备特定染色体用于构建文库或测序。
关键设备组件：
- 流体系统： 鞘液罐、样本管/上样台、流动室、压力控制系统。核心是产生稳定、层流的液流。
- 光学系统： 激光器（通常为多激光配置，如蓝光488nm、红光633nm、紫光405nm、黄绿光561nm等）、光束整形组件、一系列二向色镜和带通滤光片、光电检测器（PMT/APD）。
- 电子系统： 信号放大处理器、高速模数转换器、强大的计算机及控制分析软件。实时处理海量数据并做出分选决策。
- 分选系统： 高频压电晶体震荡器、充电电极、高压偏转板、分选收集装置（收集管、多孔板适配器），确保液滴带电和精确偏转。
- 无菌/生物安全系统（可选但重要）： 空气过滤系统、紫外灯、可选配生物安全柜集成，确保分选过程无菌或生物安全。
实验流程概述：
- 样本准备： 制备单细胞悬液（血液、组织解离、培养细胞），确保无团块、细胞活性高。进行必要的荧光标记（抗体染色、荧光染料、转染荧光蛋白等）。优化染色方案和缓冲液。
- 仪器设置与校准：
- 启动仪器，进行液流检查和光路校准（通常使用标准微球）。
- 设置激光功率、各检测器的电压增益（PMT电压）。
- 根据使用的荧光染料，设置荧光补偿矩阵（补偿调节），消除荧光染料发射光谱重叠造成的信号串扰。
- 门控策略设计：
- 采集样本数据（通常先在分析模式下运行）。
- 在获取的散点图、等高线图或密度图上，依次设定门控策略：
- FSC/SSC门（颗粒门）： 圈定活细胞或目标细胞大小/粒度范围，排除碎片、死细胞或过大细胞。
- 死活细胞鉴别门： 常用死活染料（如DAPI、PI、7-AAD等）或FSC/SSC特征区分活死细胞，选择活细胞。
- 荧光门： 根据荧光标记的组合设定逻辑门（与门AND、或门OR、非门NOT）精确定义目标群体（如CD3+ CD4+ CD25hi）。
- 分选参数设置：
- 选择目标群体（通常对应一个或多个分选管/孔）。
- 设置分选模式：纯化模式（尽可能保证目标纯度）、富集模式（追求速度，纯度稍次）、单细胞模式（确保每个孔一个细胞）。
- 设置分选速度（滴频）。
- 设置收集条件：收集管类型（离心管、流式管、多孔板）、收集液（无菌PBS、培养基、固定液等）。
- 开启液滴断点稳定（Drop Delay）校准。
- 分选执行与监控：
- 上样，开始分选。
- 实时监控分选事件率、纯度和回收率（通常通过软件显示或分选过程中短暂分流到检测器）。
- 观察液流和液滴形成是否稳定。
- 分选后处理：
- 分选完毕，立即处理分选产物：离心洗涤、重悬于合适的缓冲液或培养基。
- 进行必要的细胞计数、活性检测（如台盼蓝染色）。
- 尽快进行下游实验（培养、功能分析、核酸提取、测序等）或妥善保存。
- 数据记录与分析： 保存分选前后的数据文件（FCS格式），记录分选关键参数（门控策略、纯度和回收率、细胞总数）、样本信息和实验条件。
重要注意事项：
- 细胞活性与无菌性： 分选过程对细胞存在物理压力（鞘液压力、剪切力、电场）。优化鞘液成分和压力、保持低温（使用冷鞘液和样本）、缩短分选时间、确保无菌操作（使用无菌鞘液和耗材，开启生物安全柜模式）对维持细胞活力和防止污染至关重要。
- 纯度与得率的权衡： 高纯度通常意味着更严格的门控和可能牺牲回收率（得率）。需要根据实验目的（如功能实验需要高活性，测序需要高纯度）设定合适的分选模式。
- 分选速度与精准性： 速度越快，细胞重合通过检测点的可能性越高，可能导致分选错误或液滴含多个细胞。需要根据细胞浓度和目标群体大小调整上样速度。
- 荧光补偿： 多色实验中，精确的荧光补偿是准确识别目标群体的基础。必须使用单染样本进行补偿调节。
- 生物安全： 处理潜在传染性样本时，必须在符合生物安全等级的设施内进行，仪器需配备生物安全防护装置（如密封系统、负压），操作人员需做好个人防护。
- 数据解读： 分选结果的纯度和活性需要通过分选后重新上机检测来验证。下游实验结果需结合分选纯度、活性和细胞数量进行解读。
常见问题解答：
- Q: 流式细胞分选和流式细胞分析有何区别？
A: 流式细胞分析只提供细胞群体的多参数信息，不进行物理分离。流式细胞分选在分析的基础上，能根据设定的标准将目标细胞物理分选出来。 - Q: 分选后的细胞能直接用于培养吗？
A: 可以，但分选过程对细胞有压力，需要立即用合适培养基洗涤、重悬，并尽快放入培养箱。分选后细胞活性检测是必要的。无菌分选是前提。 - Q: 为什么需要验证分选纯度？
A: 分选过程中存在误差（如液滴异常、细胞重合、门控设置偏差），分选后验证纯度是对分选成功与否的关键确认，确保下游实验使用的是正确的目标群体。 - Q: 分选稀有细胞的关键是什么？
A: 需要大量起始样本、优化染色方案（强信号低背景）、设置精确的门控策略避免丢失目标、使用富集模式降低漏检率、保证分选系统高度稳定、分选后仔细验证。 - Q: “单细胞模式”如何保证一个孔一个细胞？
A: 单细胞模式会设定严格的参数，只在检测到单个细胞信号且液滴断点稳定时才向对应孔分配一个液滴。分选后通常需要在显微镜下确认孔内细胞数。
总结：
流式细胞分选技术凭借其高通量、多参数、高精度的特性，已成为现代生命科学和医学研究中不可或缺的“细胞分选师”。它能够从复杂的细胞混合物中“大海捞针”，分离出极少量但功能独特的细胞亚群，为深入理解细胞生物学、疾病机制、开发新型疗法以及推动单细胞组学研究提供了强大的技术支撑。掌握其原理、流程和关键注意事项，是成功运用这一强大工具的基础。随着技术的不断发展（如光谱流式分选、成像流式分选），其能力和应用范围仍在持续拓展。