生物发光强度检测

发布时间：2025-07-24 19:42:50 阅读量：1 作者：生物检测中心

生物发光强度检测：原理、方法与标准化

生物发光（Bioluminescence），即活体生物利用自身酶促反应产生可见光的自然现象，是自然界最迷人的过程之一。从深海鱼类到陆生萤火虫，从发光真菌到海洋浮游生物，这种“生命之光”不仅具有重要的生态意义，更在生物医学研究、环境监测和药物开发等领域展现出巨大的应用价值。准确检测生物发光强度是解锁这些价值的关键技术环节。

一、 生物发光原理基础

生物发光本质是化学发光的一种特殊形式，其核心在于生物体内特定的酶促反应将化学能直接转化为光能，不伴随显著的热量释放（称为“冷光”）。主要涉及以下关键要素：

  1. 发光底物（荧光素 - Luciferin）： 反应中的还原性小分子物质，种类繁多（如萤火虫荧光素、腔肠动物荧光素、细菌荧光素等），具有特定的化学结构。
  2. 催化酶（荧光素酶 - Luciferase）： 一类催化发光反应的氧化酶。不同的生物体系拥有特异的荧光素酶（如萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶、海肾荧光素酶等），它们识别并结合特定的荧光素底物。
  3. 辅助因子： 反应通常需要氧气（O₂）、三磷酸腺苷（ATP）、镁离子（Mg²⁺）、辅酶等辅助因子的参与，具体需求因不同发光体系而异。
  4. 光产生： 在荧光素酶催化下，荧光素被氧化，形成一个处于电子激发态的氧化产物（氧荧光素）。当该激发态分子回到基态时，以光子的形式释放能量，产生特定波长（通常在蓝绿光到红光范围，450-620nm）的光。
 

二、 生物发光强度检测的核心技术

检测生物发光强度的核心任务是捕获和量化这些微弱的光信号。主要依赖以下技术与设备：

  1. 核心检测设备：

    • 发光检测仪（Luminometer）：
      • 原理： 核心部件是光电倍增管（PMT）。PMT利用光电效应将入射光子转化为电子，并通过多级倍增电极进行信号放大，最终输出与入射光强度成正比的电信号。其特点是灵敏度极高（可检测单个光子），响应速度快。
      • 应用： 主要用于体外检测（in vitro），如酶标板孔（96孔或384孔板）中样本的发光强度测量。仪器通常包含自动进样、温控（保持酶反应温度稳定）、多孔连续扫描等功能，适用于高通量筛选（如报告基因检测、ATP微生物检测、免疫分析）。
    • 活体成像系统（In Vivo Imaging System, IVIS）：
      • 原理： 核心部件通常是高灵敏度、深度制冷的科学级CCD相机。CCD相机将入射光子转化为电荷并积累，通过精确控制温度和长时间曝光，可捕获生物体内或小动物模型发出的极微弱发光信号。
      • 应用： 专为活体动物（如小鼠、大鼠）或小型植物/器官的无创、实时成像设计。通过叠加发光信号与可见光照片，可以精确定位发光源在生物体内的位置，并定量不同区域的发光强度。广泛应用于肿瘤研究（监测肿瘤生长转移）、干细胞追踪、基因表达调控研究、病原体感染过程监测、药物代谢动力学研究等。
    • 微孔板读板仪（带发光检测模块）： 许多多功能读板仪集成了PMT发光检测模块，可同时或分时进行发光、荧光、吸光度等检测。

  2. 检测模式：

    • 终点法（End-point Assay）： 在反应达到稳定发光平台期或某一特定时间点进行单次读数。适用于反应动力学相对稳定或只需比较最终结果的实验（如报告基因检测）。
    • 动力学法（Kinetic Assay）： 连续监测发光强度随时间的变化，绘制发光动力学曲线。可用于研究酶反应速率、底物消耗、抑制剂/激活剂效应等。
    • 扫描成像（Imaging）： 主要应用于活体成像系统，获取生物体表面或内部发光信号的空间分布图，并进行区域定量分析。
 

三、 影响检测的关键因素与标准化

生物发光检测灵敏度极高，但也易受多种因素干扰。确保结果的准确性和可重复性至关重要：

  1. 样本因素：
    • 背景发光： 样本本身可能含有能自发产生微弱光信号（化学发光）的物质（如血红素、脂质过氧化物）。需设置空白对照（不加关键反应组分如酶或底物）予以扣除。
    • 光吸收与散射： 样本中的色素、细胞碎片、不溶物等会吸收或散射发光信号，降低检测到的强度（尤其在活体成像中）。需优化样本处理（如离心、过滤）或采用近红外发光报告系统（组织穿透性更好）。
    • 淬灭剂： 样本中某些物质可能淬灭激发态分子，降低发光效率。
    • 内源性酶/底物干扰： 某些生物样本可能含有内源性荧光素酶或荧光素类似物。
  2. 反应条件：
    • 温度： 酶反应速率高度依赖温度。必须严格控制反应温度（通常在室温或37°C）并保持一致。
    • pH值： 荧光素酶活性对pH敏感。需使用特定缓冲液维持反应体系的最佳pH（不同体系要求不同）。
    • 辅助因子浓度： ATP、Mg²⁺等辅助因子的浓度必须充足且优化。
    • 底物浓度： 底物浓度需在饱和水平（遵循米氏方程）以保证信号强度与酶量（或报告基因表达量）成正比。
    • 反应混合均匀性： 加样顺序、混匀程度影响反应起始和均一性。
  3. 仪器因素：
    • 灵敏度与线性范围： 了解所用仪器（PMT或CCD）的检测下限和线性范围，确保信号强度在最佳检测区间内。避免信号饱和。
    • 暗噪声： 仪器本身在无光条件下产生的背景信号。需定期检测和校准，高质量设备通过深度制冷可显著降低噪声。
    • 校准： 定期使用标准光源（如经标定的发光二极管LED或放射性同位素光源）校准仪器的灵敏度和线性度。
    • 孔间/位置差异： 对于微孔板检测，不同孔位或边缘效应可能导致读数差异。使用同一块板内的多点重复和随机加样顺序可减少误差。仪器应具备位置校准功能。
  4. 数据表示与标准化：
    • 相对发光单位（Relative Light Unit - RLU）： 最常用的生物发光强度单位。它是仪器检测到的原始信号（经过背景扣除）的数值表示。RLU值本身是相对的，只能在同一次实验、同一台仪器、相同设置下进行比较。
    • 标准化方法：
      • 内参： 在报告基因实验中，常使用组成型表达的第二报告基因（如萤光素酶以外的另一种酶，如海肾荧光素酶）作为内参，用目标基因发光值（RLU_Target）除以内参发光值（RLU_Internal）进行校正，消除加样误差、细胞活力和转染效率差异的影响。
      • 总蛋白浓度： 对于细胞裂解液样本，测定裂解液总蛋白浓度，将RLU值除以蛋白浓度（RLU/μg protein）进行标准化。
      • 细胞数量： 对于基于细胞的检测，可使用细胞计数法，将RLU值归一化到单位细胞数（RLU/cell）。
      • 标准曲线： 使用已知浓度的标准品（如纯化的荧光素酶、ATP）建立RLU与浓度（或活性单位）的标准曲线，将样本RLU值转化为绝对浓度或活性单位。这是最准确的定量方法，尤其适用于ATP检测等应用。
 

四、 重要应用领域

生物发光强度检测技术因其超高灵敏度、宽动态范围（可达6-8个数量级）、无需激发光源（背景极低）、操作相对简便等优势，在众多领域不可或缺：

  1. 报告基因检测： 将目的基因的启动子/增强子序列与荧光素酶基因（如萤火虫荧光素酶基因 - Luc）相连，转入细胞或生物体。通过检测发光强度，可实时、定量地监测基因转录活性，研究信号通路、启动子功能、药物作用靶点等。
  2. ATP生物发光法检测微生物： 所有活细胞均含有ATP。利用萤火虫荧光素酶体系，ATP作为必要辅助因子驱动发光反应。检测到的发光强度与ATP含量成正比，进而反映活微生物的总量。广泛应用于食品卫生、饮用水安全、制药工业清洁验证和环境微生物监测。
  3. 生物发光共振能量转移（BRET）： 当荧光素酶（供体）与荧光蛋白/染料（受体）足够接近，且供体发光光谱与受体激发光谱重叠时，供体能量可非辐射转移给受体，导致受体发光。通过检测供受体发光强度的比率变化，可实时、无创地研究活细胞内蛋白质-蛋白质相互作用及其动态过程。
  4. 活体动物光学成像： 将表达荧光素酶的细胞（如肿瘤细胞、干细胞）或病原体（如细菌、病毒）导入动物模型，或利用转基因荧光素酶动物模型，通过高灵敏度活体成像系统，无创、连续地监测疾病进展（如肿瘤生长转移、感染扩散）、干细胞归巢与分化、基因治疗表达、药物疗效与分布等，极大推进了转化医学研究。
  5. 环境监测：
    • 生物毒性检测： 利用发光细菌（如费氏弧菌）在有毒物质存在下发光强度下降的原理，快速评估水、土壤或化学品的急性毒性。
    • 特定污染物检测： 构建基因工程菌，使其发光强度响应特定污染物（如重金属、有机污染物）的浓度变化。
  6. 药物筛选与开发：
    • 高通量筛选（HTS）： 基于报告基因或酶活性的发光检测是HTS的核心技术，用于从大规模化合物库中快速筛选潜在的药物候选物（激动剂、拮抗剂、酶抑制剂等）。
    • 细胞活力/细胞毒性检测： 基于ATP含量检测的发光法（CellTiter-Glo®等类似原理）是评估药物或化合物对细胞增殖/毒性的金标准方法之一。
    • 药物代谢与药代动力学（ADME/PK）： 利用活体成像追踪标记药物或药物对报告基因表达的影响。
 

五、 结论

生物发光强度检测是一项强大而精密的工具，其核心在于利用光电倍增管或深度制冷CCD相机捕获并量化由特定生物化学反应产生的微弱光子。深入理解发光原理、掌握不同检测平台（发光检测仪 vs. 活体成像系统）的特点、严格控制实验条件（温度、pH、试剂浓度）和仪器状态、并实施严格的标准化方案（背景扣除、内参校正、标准曲线、归一化处理）是获得可靠、可重复数据的关键。随着技术的不断进步（如新型发光报告系统、更灵敏的探测器、更智能的成像分析软件），生物发光检测必将在基础生命科学研究、医学诊断、药物开发和环境监测等领域持续发挥不可替代的作用，照亮科学探索的道路。

(图表建议：可考虑在文章中插入以下示意图)

  1. 生物发光反应基本原理图（底物+酶+O₂ → 光）。
  2. 光电倍增管（PMT）工作原理简图。
  3. 活体成像系统（IVIS）工作原理示意图（动物置于暗箱，CCD相机成像）。
  4. 微孔板发光检测示意图（终点法/动力学法）。
  5. 报告基因检测原理与应用示意图（启动子调控荧光素酶表达）。
  6. ATP生物发光法检测微生物流程图。
  7. 生物发光共振能量转移（BRET）原理示意图。