生物膜形成检测

生物膜形成检测方法

生物膜是微生物（细菌、真菌等）黏附在生物或非生物表面，并被自身分泌的胞外聚合物包裹形成的结构化微生物群落。它在自然环境和医疗感染（如植入物感染、慢性伤口感染）中广泛存在，具有极强的抗药性和免疫逃逸能力。准确检测生物膜形成能力及量化其生物量，对基础研究、临床诊断和防控策略至关重要。

常用生物膜检测方法：

1. 结晶紫染色法 (Crystal Violet Staining) - 最常用的静态生物膜定量法

   • 原理： 结晶紫是一种阳离子染料，能特异性地与生物膜中带负电荷的多糖、蛋白质和核酸结合染色。
   • 步骤：
     • 将培养好的菌悬液接种到无菌平底微孔板孔中（或其它合适基底表面）。
     • 在适宜条件下（温度、时间、培养基）孵育，使菌体黏附并形成生物膜（通常需要24-72小时）。
     • 轻柔吸弃或倒掉孔内浮游菌培养液。
     • 用无菌缓冲液（如PBS）轻柔清洗孔数次，去除未黏附的松散菌体。
     • 加入适量结晶紫染液（如0.1%或1%），室温避光静置染色（通常10-20分钟）。
     • 吸弃染液，用无菌水或缓冲液反复轻柔冲洗至洗液无色，去除多余染料。
     • 自然晾干或置于适当温度下干燥。
     • 加入适量有机溶剂（如无水乙醇或95%乙醇或乙酸）溶解与生物膜结合的结晶紫染料。
     • 转移溶解液至新孔板或比色皿中，用酶标仪或分光光度计在特定波长（通常590nm或600nm附近）测定吸光度值。
   • 优点： 操作相对简单、成本低、通量高（适用于96孔板），可定量比较生物膜总生物量。
   • 缺点： 染色的是全部生物量（包括活菌、死菌和胞外基质），无法区分活死菌；染色和洗涤步骤需小心操作以避免破坏生物膜基底；需要溶解步骤；结果易受染色时间和溶解时间影响。

2. 荧光染色法 (Fluorescent Staining) - 区分活死菌及观察结构

   • 原理： 利用不同荧光染料对生物膜内活细胞、死细胞或胞外基质成分进行特异性标记。
   • 常见染料：
     • SYTO 9 & 碘化丙啶 (PI)： SYTO 9可穿透完整细胞膜染活细胞（绿色荧光），PI只能进入膜受损的细胞染死细胞（红色荧光）。两者结合可清晰区分生物膜中活菌死菌分布。
     • 钙黄绿素乙酰甲酯 (Calcein AM)： 本身无荧光，进入活细胞后被胞内酯酶水解产生荧光产物（绿色），指示活细胞。
     • 刀豆蛋白A (ConA) 等凝集素衍生物： 可标记特定多糖组分（如ConA标记α-甘露糖/α-葡萄糖）。
     • 其他染料： DAPI、Hoechst染核酸（蓝色），FITC-葡聚糖标记胞外多糖等。
   • 步骤：
     • 生物膜形成（同结晶紫法）。
     • 清洗去除浮游菌。
     • 加入含有特定荧光染料的溶液进行避光孵育染色。
     • 清洗去除多余染料。
     • 观察：用荧光显微镜直接观察生物膜结构及活死菌分布；或用荧光酶标仪定量检测特定波长下的荧光强度。
   • 优点： 可直接观察生物膜三维结构、空间分布和活死菌比例；部分染料可实现实时动态观察；信息丰富。
   • 缺点： 成本高于结晶紫；荧光显微镜观察需要专业设备，通量相对较低；定量结果的准确性受染色条件、背景荧光、光漂白等因素影响；部分染料可能有细胞毒性或光毒性。

3. 平板法/刚果红琼脂法 (Congo Red Agar Plate Method) - 表型初筛

   • 原理： 某些细菌（特别是葡萄球菌）在含有刚果红染料和特定糖源（如蔗糖）的琼脂平板上生长时，产生大量胞外多糖（形成生物膜的关键成分），会吸附刚果红染料，导致菌落呈现特征性的黑色、深棕色或结晶状外观（阳性）；不产胞外多糖或产膜能力弱的菌落则呈红色（阴性）。
   • 步骤：
     • 将待测菌划线或点种于刚果红琼脂平板（常用脑心浸液琼脂BHI + 蔗糖 + 刚果红配制）。
     • 在适宜温度下培养（通常24-48小时或更长）。
     • 观察菌落颜色和形态变化。
   • 优点： 操作最简单、成本最低，适用于大量菌株的初步快速筛选和表型鉴定。
   • 缺点： 非定量方法，只能定性判断产粗大胞外多糖的能力；灵敏度较低，对弱产膜菌株区分度差；结果判定存在主观性；并非所有产膜菌都适用此方法（特异性有限）。

4. 微孔板/96孔板法 (Tube/96-well Plate Method) - 综合应用平台

   • 原理： 利用玻璃试管或特别是带有平底的96孔微孔板作为生物膜形成的标准化基底。这是结晶紫染色法和荧光染色法最常用的承载容器。
   • 步骤： 如结晶紫染色法和荧光染色法所述。
   • 优点： 标准化程度高，重复性好；通量极大（尤其96孔板）；便于清洗、染色、定量等自动化操作；节省试剂和样品。
   • 缺点： 材料表面的性质（疏水性等）会影响细菌黏附；孔壁边缘效应可能造成生物膜生长不均；定量依赖于后续的染色步骤。

方法选择与关键考量：

• 目的：
  • 快速初筛大量菌株？ → 平板法。
  • 定量比较总生物量？ → 结晶紫染色法（微孔板）。
  • 观察生物膜结构、活死菌分布？ → 荧光染色法 + 显微镜。
  • 实时动态监测生物膜形成？ → 连续流系统或特定荧光染料。
• 通量要求： 高通量首选结晶紫微孔板法或荧光微孔板定量法。
• 设备条件： 有无荧光显微镜、荧光酶标仪等。
• 研究对象： 细菌、真菌种类不同，方法需优化（培养时间、培养基等）。
• 结果可靠性： 建议结合至少两种方法进行验证（如结晶紫定量+荧光显微镜观察）。

实验要点：

• 标准化： 严格控制菌液浓度、接种量、培养时间、温度、培养基成分、洗涤次数和力度等变量。
• 对照设立： 必须设置：
  • 阴性对照： 只含培养基不含菌液的孔/管/平板（检测背景值）。
  • 阳性对照： 已知强产膜能力的标准菌株（如铜绿假单胞菌PAO1、金黄色葡萄球菌ATCC 35984等），验证实验体系有效性。
  • 空白基底对照： （尤其在荧光染色时）仅对附着面进行染色处理，排除基底自身荧光或染料非特异性吸附。
• 培养基选择： 常用适合生物膜生长的营养丰富培养基，如胰酶大豆肉汤、脑心浸液肉汤等（通常需添加适量葡萄糖）。
• 培养时间： 需根据菌种特性优化，通常需要足够时间（24-72小时）让生物膜成熟稳定。
• 洗涤操作： 是关键步骤！需轻柔操作以避免破坏已形成的生物膜结构，同时要彻底洗去未黏附的浮游菌。使用缓冲液（如PBS）洗涤效果更佳。
• 结果判读：
  • 定量（OD值/荧光强度）： 减去阴性对照值；设定阈值判定产膜能力强弱（如OD > 0.1 为强阳性）；比较均值±标准差，进行统计学分析。
  • 定性（平板法/显微镜）： 根据明确的形态学标准（颜色、质地、厚度）进行判读，最好有经验人员或多位观察者共同判定。

结论：

生物膜形成检测是一个多方法共存的领域，每种方法各有优劣和适用场景。结晶紫染色微孔板法因其简便、高通量和良好的定量性，成为实验室最常用的标准方法。荧光染色技术则提供了关于生物膜结构和活性的宝贵信息。刚果红琼脂法适用于高通量初筛。研究者应根据具体实验目的、样品数量、设备条件和所需信息深度来选择最合适的一种或多种组合方法，并结合严格的实验设计和对照设置，才能获得可靠、可重复的生物膜形成能力评估结果。深入理解生物膜的形成机制和特性，对于开发有效的抗生物膜策略具有重要意义。

方法选择参考表：

此表总结了关键方法的特性对比，有助于根据实验需求选择最合适的检测方案。