支原体污染检测 - 中析研究所生物检测中心

支原体污染检测：原理、方法与防控策略

支原体污染是细胞培养、生物制品生产及基础研究中普遍且严重的问题。这种缺乏细胞壁、形态微小的微生物难以察觉，却能显著干扰实验结果、降低细胞活力和产率，甚至威胁生物制品的安全性。因此，建立有效可靠的支原体检测体系至关重要。

一、支原体污染的来源与危害

主要来源：
- 引入污染： 原始细胞系/株、血清（尤其胎牛血清）、胰酶等消化液、实验操作人员（口腔支原体）。
- 交叉污染： 污染细胞系、共用培养基或试剂、培养箱内气溶胶传播。
- 环境因素： 实验室空气、不洁的CO2培养箱水盘。
严重危害：
- 细胞层面： 生长缓慢或停滞、形态改变、异常聚集、死亡增加、代谢改变、染色体畸变、基因表达谱异常。
- 实验结果： 数据不可靠、重复性差、结论错误。
- 生物制品： 潜在病毒污染载体、影响疫苗/治疗性蛋白的效价与安全性。

二、核心检测方法

培养法（金标准）：
- 原理： 将待测样本接种于富含营养和指示细胞（如Vero细胞）的液体和固体培养基中，支原体代谢产酸使液体培养基pH值下降（酚红指示剂变黄），或在固体培养基上形成特征性“煎蛋状”菌落。
- 优点： 特异性高，可分离并鉴定活的支原体，是国际公认的参考方法。
- 缺点： 耗时长（液体培养需4-7天，固体培养需2-4周观察），灵敏度受支原体种类影响（某些株难培养），操作繁琐（需无菌条件）。
- 关键点： 需同时使用液体和固体培养基，并包含阳性、阴性对照。观察固体培养基菌落需染色（如Dienes染色）辅助确认。
DNA荧光染色法（指示细胞法）：
- 原理： 利用Hoechst 33258等荧光染料特异性结合DNA。将待测样本与易感指示细胞（如Vero细胞）共培养数日，固定细胞后染色。支原体DNA附着在真核细胞表面或周围，在荧光显微镜下呈现特异性荧光颗粒或丝状结构。
- 优点： 相对快速（通常3-5天），成本较低，可直观观察污染位置，能检测难培养支原体。
- 缺点： 主观性强（依赖观察者经验），灵敏度低于分子方法，易受细胞碎片或操作污染干扰产生假阳性/阴性。
- 关键点： 必须设置严格的阳性和阴性对照。指示细胞状态需良好，避免自身产生碎片干扰。
核酸扩增技术（NAT）：
- 原理： 通过聚合酶链式反应（PCR）或定量PCR（qPCR）扩增支原体特异性保守基因片段（如16S rRNA基因、23S rRNA基因、核糖体蛋白基因rpoB等），经电泳或荧光信号检测。
- 优点： 灵敏度最高，特异性强（经引物设计保证），检测快速（数小时至1天），高通量，可自动化。
- 缺点： 无法区分死菌/活菌（需结合活菌指示或样品预处理），需要专业设备和技术人员，成本相对较高。
- 关键点： 引物设计至关重要，需覆盖常见污染支原体种属（如M. orale, M. hyorhinis, M. arginini, M. fermentans, A. laidlawii等）。严格防止交叉污染（假阳性）。建议采用经充分验证的引物探针组合。

三、方法比较与选择策略

检测方法	灵敏度	检测时间	能否区分活/死	操作复杂性	主要优势	主要局限
培养法	中-高	2-4周	是	高	金标准，特异性高，能分离鉴定	耗时长，某些支原体难培养
荧光染色法	中	3-5天	是	中	成本低，直观，可检测难培养株	主观性强，灵敏度较低
核酸扩增法	最高	数小时-1天	否	中-高	快速、高灵敏度、高通量	不能区分活/死，需防污染，设备依赖

选择依据： 根据检测目的（日常监控 vs 放行检测）、样本类型、所需灵敏度/速度、实验室条件及预算综合考量。
推荐策略： 核酸扩增法（PCR/qPCR） 因其速度与高灵敏度，已成为目前主流的筛查和检测手段，尤其适用于细胞库检定和生物制品放行。培养法 作为重要的确认方法。荧光染色法 适用于预算有限或需直观观察的实验室。