非无菌产品生物负载检测

发布时间：2025-07-24 14:53:05 阅读量：2 作者：生物检测中心

非无菌产品生物负载检测：原理、方法与应用

一、定义与重要性

生物负载（Bioburden），指存在于原料、包装或成品上（内部或表面）的活微生物总数。对于非无菌产品（如部分医疗器械、化妆品、原料药、辅料、部分药品制剂、植物提取物等），生物负载检测是至关重要的质量控制环节：

  1. 评估微生物污染水平： 直接反映产品生产、包装、储存等环节的卫生控制状况。
  2. 支持灭菌/消毒工艺验证： 确定灭菌前初始污染菌水平，是计算灭菌保证水平（SAL）的关键输入。
  3. 过程控制与改进： 识别生产过程中的微生物污染风险点，指导清洁消毒程序优化。
  4. 稳定性与有效期评估： 监测产品在储存期内微生物数量的变化趋势。
  5. 法规符合性： 满足国内外药典（如 USP、EP、ChP）、医疗器械法规（如 ISO 13485, FDA QSR）及化妆品法规等对微生物控制的要求。
 

二、核心检测标准与方法选择

主要依据 ISO 11737-1:2018 Sterilization of health care products — Microbiological methods — Part 1: Determination of a population of microorganisms on products 及相关药典通则（如 USP <60> Microbiological Examination of Nonsterile Products — Tests for Burkholderia cepacia complex, USP <61> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests, EP 2.6.12, ChP 1101/1105/1106）。

  • 方法选择原则：

    • 产品特性： 物理形态（固体、液体、粉末、凝胶）、水溶性、抑菌性、pH值等。
    • 预期用途与法规要求。
    • 方法的适用性（回收率）、准确度与精密度。

  • 常用方法：

    1. 薄膜过滤法 (Membrane Filtration Method):
      • 原理： 将定量的供试液通过孔径 ≤ 0.45 μm 的滤膜，微生物被截留在膜上，冲洗去除抑菌成分后，将滤膜贴于琼脂培养基上培养计数。
      • 适用： 具有抑菌性（水溶性）的液体样品、可溶于水或稀释后无抑菌性的样品。是处理含抑菌成分样品的首选。
      • 关键点： 有效冲洗去除抑菌物；选择合适培养基（如胰酪大豆胨琼脂 TSA, 沙氏葡萄糖琼脂 SDA）；验证冲洗有效性（回收率）。
    2. 平皿倾注法 (Pour Plate Method):
      • 原理： 将定量的供试液与熔化的琼脂培养基混合，倾注入平皿，凝固后培养，菌落生长在琼脂内部和表面。
      • 适用： 大多数水溶性良好的非抑菌性液体样品。
      • 关键点： 琼脂温度控制（约 45°C）；混匀避免气泡。
    3. 平皿涂布法 (Spread Plate Method):
      • 原理： 将定量的供试液滴加到已凝固的琼脂平板上，用涂布棒均匀涂布于表面，培养后计数表面生长的菌落。
      • 适用： 非抑菌性或经中和后的液体样品，尤其适合对氧气敏感的微生物。
      • 关键点： 供试液吸收完全；涂布均匀。
    4. 最可能数法 (Most Probable Number - MPN Method):
      • 原理： 将样品进行一系列梯度稀释，分别接种于液体培养基管中，根据出现生长的管数组合，查 MPN 表估算样品中的微生物数量。统计概率方法。
      • 适用： 微生物数量很低 (<100 CFU/g 或 ml) 或含有颗粒/沉淀干扰计数的样品。灵敏度较高但精密度较差。
      • 关键点： 选择合适的稀释梯度和接种量；验证方法适用性。
    5. 直接接种法 (Elution/Swab Method for Surfaces):
      • 原理： 对于难以溶解或取样的固体表面，常用棉签擦拭法或浸泡洗脱法将微生物从产品表面转移到洗脱液中，再对洗脱液进行上述方法（膜过滤、倾注、涂布）检测。
      • 适用： 大型设备、器具、包装材料、医疗器械表面、不溶性固体产品。
      • 关键点： 选择有效且无毒的洗脱液（如含表面活性剂的缓冲液）；充分洗脱/擦拭；验证洗脱效率。
 

三、检测流程关键步骤

  1. 样品选取与处理：

    • 代表性取样： 按预定抽样计划进行，考虑生产批次、时间点、设备位置等。
    • 无菌操作： 所有操作在适当级别的洁净环境（如生物安全柜）中进行，防止二次污染。
    • 样品制备：
      • 液体： 直接或稀释后检测。注意均质。
      • 固体/粉剂： 需加入稀释液（如含中和剂的蛋白胨缓冲盐溶液）均质或振荡洗脱，制成均匀的供试液。
      • 表面擦拭/洗脱： 按预定方法进行。
    • 中和/消除抑菌性： 若产品含防腐剂或具有抑菌性，必须在供试液制备过程中加入有效中和剂（如卵磷脂聚山梨酯80中和体系、硫代硫酸钠、组氨酸等），并进行中和剂有效性验证（回收率试验）。

  2. 供试液制备与稀释：

    • 根据预估的生物负载水平，制备适当浓度的供试液。
    • 采用十倍梯度稀释法（用稀释液）获得多个稀释级。
    • 每个稀释级制备需充分混匀。

  3. 接种与培养：

    • 根据所选方法（膜过滤、倾注、涂布、MPN管），取规定量的供试液或稀释液进行接种。
    • 培养基选择：
      • 需氧菌总数 (TAMC)： 胰酪大豆胨琼脂 (TSA) 或营养琼脂 (NA)，通常 30-35°C 培养 3-5 天。
      • 霉菌和酵母菌总数 (TYMC)： 沙氏葡萄糖琼脂 (SDA)，通常 20-25°C 培养 5-7 天。有时需加入抗生素抑制细菌。
    • 培养条件： 严格按标准要求控制温度、湿度、时间。必要时进行厌氧培养。

  4. 菌落计数与计算：

    • 选择生长菌落数在 30-300 CFU（或 25-250 CFU，视标准而定）的平板进行计数。若所有稀释级均不在范围内，取最接近30-300 CFU的平板计数或报告估算值。
    • 计算：
      • 膜过滤、倾注、涂布法： 平均菌落数 × 稀释倍数 × (1 / 接种体积) = XX CFU/g 或 CFU/ml 或 CFU/件。
      • MPN法： 根据阳性管组合查 MPN 表得出估计值。
      • 表面擦拭/洗脱法： 结果表示为 CFU/件 或 CFU/cm²。
    • 报告： 通常报告需氧菌总数 (TAMC) 和霉菌酵母菌总数 (TYMC)。结果应标明检测方法和单位。
 

四、方法学验证 (Validation)

在正式开展产品检测前，必须进行方法适用性验证，核心是回收率试验 (Method Suitability Test / Recovery Efficiency Test)：

  1. 目的： 证明所建立的方法能有效检出样品中的微生物（克服抑菌性、洗脱效率等），确保结果准确可靠。
  2. 步骤：
    • 制备低生物负载的样品或模拟样品。
    • 接种少量（通常 <100 CFU）已知浓度的代表性标准菌株（如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉等）。
    • 按建立的方法进行检测。
    • 计算回收率：(检出菌落数 / 实际加入菌落数) × 100%。
  3. 可接受标准： 通常要求回收率 ≥ 70%（如 USP <61>/<1227>， EP 2.6.12），且菌落形态无明显变化。需对需氧菌和霉菌/酵母菌分别验证。
 

五、结果解读与应用

  1. 与产品标准对比： 将检测结果与产品放行标准（基于风险评估、历史数据、法规要求制定）进行对比，判断是否合格。
  2. 趋势分析： 长期监测数据用于分析生物负载水平的变化趋势，评估生产过程的稳定性。
  3. 支持灭菌验证： 提供生物负载平均值和置信上限，用于计算灭菌剂量（如辐照、环氧乙烷灭菌）。
  4. 调查与改进： 若结果异常或超标，需启动调查，查找污染源，采取纠正预防措施（CAPA）。
 

六、注意事项

  1. 环境控制： 检测实验室环境应符合微生物检测要求（如洁净度、温湿度控制）。
  2. 人员资质： 操作人员需经过专业培训。
  3. 培养基质量控制： 定期进行培养基适用性检查（促生长能力、无菌性、抑制能力）。
  4. 稀释液与试剂： 确保无菌、无抑菌性。
  5. 记录与追溯： 详细记录所有操作步骤、参数、结果，确保数据完整可追溯。
  6. 生物安全： 遵循实验室生物安全规范。
 

总结：

非无菌产品的生物负载检测是保障其微生物安全性和有效性的重要基石。通过科学选择并验证合适的检测方法（如薄膜过滤法、平皿法、MPN法、洗脱法），严格遵守标准操作规程（SOP），并特别关注样品中和与回收率验证等关键点，才能获得准确可靠的数据。这些数据不仅用于产品放行，更是监控生产过程、验证灭菌效果、评估产品稳定性以及持续改进质量管理体系的核心依据。规范且有效的生物负载控制程序对于确保非无菌产品的质量和用户安全至关重要。