生物负载检测方法确认 - 中析研究所生物检测中心

生物负载检测方法确认：完整指南

1. 引言

生物负载检测是制药、医疗器械、生物制品及相关行业质量控制的关键环节，用于定量测定非无菌产品或其组分中存活的微生物（细菌、酵母菌和霉菌）数量。为确保检测结果的准确性、可靠性和一致性，必须对所采用的生物负载检测方法进行科学、全面的确认。本确认过程旨在证明该方法适用于其预期目的，并满足相关法规和标准（如各国药典、ISO 11737-1、ICH Q2(R1)等）的要求。

2. 方法确认的目的与范围

目的：
- 证明方法的适用性：确认该方法能够准确、可靠地检测和计数样品中的微生物。
- 确保结果的可靠性：验证方法在常规使用条件下能提供一致、可重现的结果。
- 满足法规要求：符合药品、医疗器械等相关法规和质量管理体系（如GMP/GDP）的强制性要求。
- 指导日常检测：为方法的常规转移和实施提供科学依据。
范围： 涵盖生物负载检测方法的全过程，包括但不限于：
- 样品前处理（如溶解、稀释、分散、均质）。
- 微生物的洗脱/回收（如适用）。
- 培养基的选择和适用性检查。
- 接种技术（倾注平板法、薄膜过滤法、螺旋平板法、MPN法等）。
- 培养条件（温度、时间、需氧/厌氧环境）。
- 菌落计数技术及结果计算。

3. 确认的基本原则

“方法匹配产品”原则： 确认必须针对特定的产品或材料进行，确认结果仅适用于该产品或具有足够相似性的同类产品。
风险评估： 基于产品和工艺的知识，识别方法的关键步骤和潜在变异来源，确定需要重点确认的参数。
科学性与统计学： 实验设计需科学合理，使用适当的统计方法评估数据（如平均值、标准差、置信区间、回收率计算）。
合规性： 符合适用的药典（如 USP <61>， EP 2.6.12, ChP 1105/1106）、ISO 11737-1以及相关法规指南（如 FDA 指南、ICH Q2(R1)）的要求。

4. 关键确认参数及评估

通常需要评估以下性能参数：

4.1 专属性/选择性：
- 目的： 证明方法能够准确检测目标微生物（活菌），并区分它们与样品本身、可能的干扰物质（如抑菌成分、颗粒物、颜色）或污染物。
- 确认要点：
  - 样品干扰试验： 将低水平（接近预期限度或方法计数下限）的试验菌悬液接种到含样品（或代表性模拟样品）和无样品（阴性对照）的培养基中/上。比较两组的菌落计数结果。
  - 菌种鉴定： 必要时对从确认试验或日常检测中分离的典型菌落进行鉴定，确认其为目标微生物。
4.2 准确性/回收率：
- 目的： 评估方法从产品或材料中回收微生物的效率（回收率）。是生物负载方法确认的核心参数。
- 确认要点：
  - 人工污染（加标）试验： 使用已知数量（通常为50-200 CFU）的代表性试验菌种（需覆盖革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌，至少包括环境分离株或标准菌株），接种到待测样品中。按常规方法处理后进行检测计数。
  - 计算： 回收率 (%) = (加标样品的平均检出菌落数 - 未加标样品的平均本底菌落数) / 加入的已知菌落数 × 100%。
  - 可接受标准： 通常要求回收率 ≥70%（如USP <1227>推荐）。对于薄膜过滤法，回收率应不低于50%。需设定合理且有科学依据的内部标准。
4.3 精密度：
- 目的： 评估方法的重复性（实验室内变异）和中间精密度（实验室内不同日期、不同人员、不同设备的变异）。
- 确认要点：
  - 重复性： 由同一分析人员，在相同的仪器和短时间内，对同一份加标样品（通常覆盖低、中水平）进行多次（如n=3或n=5）独立检测。计算结果的相对标准偏差 (RSD)。
  - 中间精密度： 由不同分析人员在不同日期（可能使用不同设备），对同一份加标样品进行检测。评估不同因素引起的变异。
  - 可接受标准： RSD一般应 ≤35%（尤其在计数接近检测限时）；对于较高的计数，RSD应更低（如 ≤15-20%）。具体标准需基于产品风险和计数水平设定。
4.4 检测限与定量限 (适用时)：
- 目的：
  - 检测限 (LOD)： 样品中能被可靠检出的最低微生物数量（不一定准确定量）。
  - 定量限 (LOQ)： 样品中能被可靠定量（具有可接受的准确度和精密度）的最低微生物数量。对于定量性质的生物负载检测（尤其是低生物负载产品），LOQ更关键。
- 确认要点（如需要）：
  - 通常通过系列稀释人工污染样品，找到能检测到或准确定量的最低污染水平，并结合空白样品的本底和精密度数据进行评估。可能涉及概率法（如Probit分析）或信噪比法。
4.5 线性与范围 (适用性有限)：
- 目的： 在生物负载检测中主要用于评估培养基的适用性（如滴定法检查促生长能力），或在特定情况下评估稀释步骤的有效性。
- 确认要点： 通常不是生物负载计数方法确认的常规重点，除非方法涉及复杂的定量分析（如基于ATP等）。
4.6 耐用性/稳健性 (Robustness)：
- 目的： 评估方法参数在有意的小幅度合理变动（如孵育温度±2°C，培养时间±10%，培养基批次更换，不同分析人员操作，不同均质器/过滤设备）下，保持结果不受影响的能力。识别关键操作参数。
- 确认要点： 有目的地改变一个或几个预选的可能影响结果的操作参数，使用加标样品进行测试，比较结果与标准条件下的差异（如回收率、精密度）。
4.7 计数方法验证：
- 明确验证所采用的计数方法（如目测标准平板、自动菌落计数仪）。
- 确保计数规则清晰一致（如如何计数重叠菌落、蔓延菌落、微小菌落）。
- 若使用自动计数仪，需对该仪器的方法进行单独的确认/验证。

5. 样品前处理方法的确认 (关键)

洗脱/分散/均质方法的有效性直接影响回收率。
确认要点：
- 洗脱效率： 评估物理方法（震荡、涡旋、超声、均质）或化学方法（添加中和剂、表面活性剂）从样品中释放微生物的能力。通过加标回收率试验评估。
- 中和有效性： 如果样品含有抑菌/杀菌成分，必须确认添加的中和剂能有效中和其活性，且中和剂本身不影响微生物生长。通过中和剂有效性试验评估（如接种-回收试验）。
- 处理条件优化： 确认关键参数（如均质时间、转速、温度）对回收率的影响，并设定最佳操作范围。此范围需在耐用性试验中考察。

6. 培养基适用性检查

所有使用的培养基（稀释液、洗脱液、琼脂培养基）必须符合药典规定的促生长性能（生长能力）和抑制性能（无菌性检查）。
促生长能力： 用少量（<100 CFU）的代表性试验菌株接种培养基，应能生长良好。
无菌性： 培养基本身应无菌（或控制污染在一定限度内）。
选择性 (如适用)： 若使用选择性培养基，需确认其能抑制非目标菌同时允许目标菌生长。

7. 人员资质与培训

执行方法确认和日常检测的人员必须经过充分的微生物学理论、无菌操作技术、具体检测方法和实验室安全方面的培训。
培训效果需进行考核评估（如理论考试、实操演示），并记录存档。
人员需具备识别典型菌落形态的能力。

8. 实验设计与实施

试验菌株选择： 选择具有代表性的环境分离株（首选）和/或标准菌株（如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）。菌株应涵盖预期的微生物污染类型。
样品选择： 使用实际产品或代表性模拟样品（需论证代表性）。
对照设置：
- 阳性对照： 加标样品（用于回收率、精密度）。
- 阴性对照/方法空白： 不含样品的稀释液/培养基（检测污染）。
- 培养基空白： 未接种的培养基平板/滤膜（检测无菌性）。
- 稀释液/洗脱液空白： 检测稀释/洗脱过程的污染。
重复次数： 每个确认参数（尤其是回收率、精密度）需要足够的重复次数（通常n≥3）以获得可靠的统计数据。

9. 环境控制与设备校准

确认实验应在满足要求的受控环境（如洁净室、生物安全柜、层流工作台）中进行。
所有关键设备（培养箱、天平、均质器、pH计、过滤装置、温度计等）需定期校准/检定，并在有效期内。校准状态应有明确标识和记录。

10. 结果分析与报告

对所有获得的数据进行整理和统计分析（计算平均值、标准偏差、RSD、回收率、置信区间等）。
将结果与预先设定的、基于科学和法规的可接受标准进行比较。
撰写确认报告： 报告应清晰、完整地包含以下内容：
- 确认目的和范围。
- 详细的方法描述（包括样品处理、所用培养基、设备、试验菌株）。
- 实验设计和方案（包括确认参数、可接受标准、样品批次、重复次数）。
- 原始数据和详细计算结果（列表、图表）。
- 结果分析（是否符合可接受标准）。
- 结论：明确声明确认的方法是否适用于其预期目的。
- 偏差处理（如有）。
- 参考文献（法规、标准、方法来源）。
- 批准签名和日期。
确认报告应经过审核和批准。

11. 方法的生命周期管理

转移： 如果方法需要转移到其他实验室，应进行方法转移确认（部分或重复关键参数）。
再确认/变更控制：
- 定期再确认： 根据风险评估制定周期（如每年），或在发生可能影响方法性能的重大变更后进行。
- 变更触发再确认： 当发生可能影响方法性能的变更时（如关键试剂供应商变更、主要设备变更、样品配方/工艺重大变更、检测环境变更、结果异常增多），必须评估影响并进行必要的再确认。
日常质量控制： 在日常检测中，采用适当的质量控制措施（如定期使用参考物质、培养基适用性检查、环境监测、人员能力持续评估）来持续保证方法性能。

12. 方法确认要点清单摘要

明确目标： 为何产品/材料？用什么具体方法？
评估关键参数： 专属性（干扰）、回收率（核心）、精密度（重复性、中间）、耐用性（参数变动）、检测/定量限（如关键）。
严控样品处理： 洗脱/分散/均质效率、中和有效性（关键！）。
培养基合格： 促生长、无菌性、选择性（如适用）必须检查。
人员要专业： 充分培训、考核、具备菌落识别能力。
设计要科学： 代表性菌株和样品、充足重复、严格对照（阳性、阴性、空白）。
环境设备合规： 洁净环境、设备校准有效。
数理统计支撑： 计算回收率、RSD等，对比预定标准。
完整报告定论： 详细记录分析，清晰结论，严格审批。
持续管理： 控制变更、定期/触发再确认、加强日常质控。

结论

生物负载检测方法的确认是一个系统化、基于科学和法规要求的过程。通过精心设计实验、严格评估关键性能参数（尤其是回收率和精密度）、确认样品处理的有效性、确保培养基和人员资质、控制环境设备，并建立完善的生命周期管理策略，可以确保所建立的生物负载检测方法能够持续、稳定地提供准确可靠的结果，为产品质量安全和法规符合性提供坚实的基础保障。确认工作是GMP/GDP质量体系不可或缺的重要组成部分。