圆二色谱分析（CD）

发布时间：2025-06-11 16:36:06 阅读量：9 作者：生物检测中心

圆二色谱分析：揭示分子手性与构象奥秘的光学探针

圆二色谱（Circular Dichroism, CD）是一种基于光学活性的重要光谱技术，专门用于研究手性分子（特别是生物大分子）的结构、构象变化及相互作用。其核心原理在于探测物质对左旋圆偏振光（L-CPL）和右旋圆偏振光（R-CPL）吸收的差异。

一、 核心原理：源于电磁波与手性物质的量子相互作用

  1. 圆偏振光与手性： 普通平面偏振光可分解为振幅相等、相位相差90度的左旋和右旋圆偏振光。当这种光通过手性物质时，物质中处于基态的手性生色团（如蛋白质的肽键、核酸的碱基）对L-CPL和R-CPL的吸收系数（ε_L 和 ε_R）不相等。
  2. 圆二色性定义： 这种吸收差异被称为圆二色性，通常用吸收差值 ΔA (ΔA = A_L - A_R) 或摩尔椭圆度 [θ] 来表示。ΔA 与摩尔吸光系数差值 Δε (Δε = ε_L - ε_R) 直接相关。
  3. 物理机制： CD信号的产生源于手性分子中电子跃迁的电偶极矩与磁偶极矩之间的量子力学干涉效应。只有满足特定对称性要求（如无对称中心、无对称面）的跃迁才能产生CD信号。
  4. CD谱图： CD光谱仪测量的是ΔA或[θ]随入射光波长（通常在远紫外170-250 nm、近紫外250-350 nm和可见光350 nm以上区域）变化的关系曲线。正峰表示对L-CPL吸收更强，负峰表示对R-CPL吸收更强。峰的位置、符号、强度和形状蕴含丰富的结构信息。

二、 仪器构成：精密的光学测量系统

一台典型的CD光谱仪包含以下核心组件：

  1. 光源： 通常采用稳定的氙灯或高压汞灯，提供连续光谱。
  2. 单色器： 将光源发出的连续光色散，选择特定波长的单色光输出。
  3. 起偏器： 将单色光转变为平面偏振光。
  4. 光电调制器（PEM）： CD光谱仪的核心部件。通常由压电晶体驱动的一块光学各向异性晶体（如石英）构成，在特定频率的交流电压作用下，交替产生左旋和右旋圆偏振光。
  5. 样品室： 放置待测样品（溶液或薄膜），通常配备温控装置（如帕尔贴控温）以研究温度效应。
  6. 检测器： 高灵敏度的光电倍增管（PMT）或半导体检测器，探测透过样品的光强度。
  7. 锁相放大器与数据处理系统： 检测器信号与PEM的驱动信号同步，通过锁相放大技术精确测量微弱的ΔA信号，并实时记录、处理和显示CD光谱。

三、 数据解读：从光谱到结构信息

  • 定性分析：

    • 手性中心识别： 确认化合物是否具有手性。
    • 绝对构型确定： 通过与已知构型的类似物或计算模拟（如TD-DFT）的CD谱图比较，推断手性分子的绝对构型（R/S或D/L）。
    • 构象分析： 对生物大分子（蛋白质、核酸、多糖）尤为重要。不同二级结构（如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲）具有特征性的CD谱图：
      • 蛋白质： α-螺旋在222 nm（负峰）、208 nm（负峰）和192 nm（正峰）附近有特征峰；β-折叠在215-218 nm（负峰）附近有峰；无规卷曲在198 nm附近有强负峰。
      • 核酸： B型DNA在245 nm（负峰）和278 nm（正峰）附近有特征峰；A型、Z型DNA及不同构象的RNA具有不同的特征谱。
      • 糖类： 可用于分析多糖的糖环构象和糖苷键构象。

  • 定量分析：

    • 二级结构含量估算： 利用蛋白质在远紫外区的CD谱，通过算法（如Contin、SELCON、CDSSTR）将其分解为标准二级结构组分的线性组合，从而估算样品中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲的相对含量。
    • 结合常数测定： 研究手性分子间的相互作用（如蛋白质-配体、蛋白质-核酸、主客体包合）。通过监测特定波长CD信号强度随浓度（如配体浓度）的变化，拟合得到结合常数（Ka）、化学计量比（n）和热力学参数（ΔH, ΔS）。
    • 稳定性研究： 监测CD信号随温度（热变性）、pH、变性剂浓度（化学变性）的变化，可研究生物大分子的折叠/去折叠过程（变性曲线），计算热力学参数（如Tm, ΔG, ΔH, ΔCp）。

四、 核心应用领域

  1. 生物大分子结构生物学：
    • 蛋白质二级结构快速评估、折叠状态监测。
    • 蛋白质折叠/去折叠动力学和热力学研究。
    • 蛋白质与核酸、小分子药物、金属离子、辅因子等的相互作用分析。
    • 核酸构象研究（B-DNA, A-DNA, Z-DNA, G-四链体, i-motif, RNA折叠等）。
    • 多糖构象分析。
  2. 不对称合成与药物化学：
    • 手性化合物绝对构型鉴定。
    • 监测不对称合成反应进程和产物光学纯度（通过[θ]值）。
    • 手性药物分子的构效关系研究。
  3. 超分子化学：
    • 研究手性超分子组装体的形成（如手性聚合物、液晶、自组装膜、凝胶）。
    • 主客体化学中手性识别的表征。
  4. 材料科学：
    • 手性纳米材料（如金纳米团簇、量子点、手性MOF）的光学活性表征。
    • 手性高分子材料的结构分析。

五、 优势与局限性

  • 优势：
    • 对溶液状态下手性分子的结构变化极其灵敏（尤其生物大分子构象变化）。
    • 样品用量少（微克至毫克级），对样品破坏性小。
    • 测试速度快，可进行时间分辨和变温研究。
    • 仪器相对普及，操作便捷。
  • 局限性：
    • 通常需溶液样品（高浓度可能导致聚集散射干扰），固体样品测量有挑战（需特殊附件）。
    • 远紫外CD测量对溶剂纯度和样品池光程要求高（需高真空或氮气吹扫除氧）。
    • 复杂混合物的谱图解析困难，需结合其他技术（如X射线晶体学、NMR、计算模拟）。
    • 只能提供整体平均的结构信息，难以解析局部细微结构。
    • 绝对构型确定有时需要参照物或理论计算支持。

六、 数据处理关键点

  1. 溶剂背景扣除： 至关重要！ 必须测量完全相同条件下（相同光程、溶剂、温度）的空白溶剂（或缓冲液）的CD信号，并从样品信号中扣除。
  2. 浓度与光程： 准确知道样品浓度（摩尔浓度）和样品池光程（通常0.01-1 cm），才能计算摩尔椭圆度[θ]或Δε，进行定量比较。
  3. 单位转换： CD信号常用毫度（mdeg）显示，需转换为摩尔椭圆度[θ] (deg cm² dmol⁻¹) 或摩尔二色性Δε (L mol⁻¹ cm⁻¹) 进行定量分析。转换公式：[θ] = (ΔA * 100 * M) / (c * l)，其中M为分子量(g/mol)，c为浓度(g/mL)，l为光程(cm)。
  4. 平滑与降噪： 适当的光谱平滑处理（如Savitzky-Golay）可提高信噪比，但需谨慎避免过度平滑导致特征峰失真。
  5. 二级结构分析： 选择合适的光谱范围（通常190-240 nm）和参考数据库（如SP175），并理解所用算法的局限性和假设。

七、 发展前沿

  • 同步辐射圆二色谱（SRCD）： 利用同步辐射源的高强度、宽波长范围（可低至真空紫外区~130 nm），显著提高了信噪比、光谱范围和探测灵敏度，尤其有利于富含β-折叠的蛋白质和膜蛋白研究。
  • 振动圆二色谱（VCD）： 探测分子在红外区的振动跃迁对圆偏振光的吸收差异，提供基态手性分子的振动能级信息，是确定有机小分子绝对构型的强有力工具（常与计算结合）。
  • 荧光检测圆二色谱（FDCD）： 探测手性荧光团发射荧光的圆偏振差异，结合了CD的选择性和荧光的高灵敏度。
  • 时间分辨CD： 结合快速混合或光触发技术，研究生物大分子折叠、酶反应等过程的动力学（毫秒至秒级）。
  • 显微成像CD： 将CD与显微技术结合，研究微米尺度上手性材料或细胞区域的光学活性。

总结

圆二色谱分析作为一种灵敏、高效、无损的光谱技术，在揭示手性分子的立体化学结构、生物大分子的溶液构象及其动态变化方面发挥着不可替代的作用。它不仅是生物化学、结构生物学、药物研发领域的常规表征手段，也是不对称合成化学和先进材料科学中的重要分析工具。随着光源技术（如同步辐射）、探测器技术、计算方法（如量子化学计算、机器学习）的不断发展，CD技术将继续拓展其应用边界，为科学家们深入理解分子世界的“手性之美”提供更强大的洞察力。