灭菌效果模拟使用测试

一、引言

在医疗、制药、生物实验室、食品加工等诸多领域，灭菌过程是保障产品安全、防止交叉感染、确保实验可靠性的核心环节。灭菌失败可能带来严重后果。直接使用目标灭菌对象或其培养物进行灭菌效果验证不仅周期长、成本高，还可能存在生物安全风险。因此，灭菌效果模拟使用测试（也称为灭菌挑战性试验或生物指示剂挑战性试验）成为验证灭菌工艺可靠性和一致性的黄金标准方法。

二、测试目的与原理

核心目的： 客观评估在特定灭菌程序（特定灭菌剂、参数如温度/压力/浓度/时间、装载方式）下，模拟实际使用中最难灭菌的物质或位置，其灭菌效果是否达到预定的无菌保证水平（Sterility Assurance Level, SAL），通常要求达到 SAL ≤ 10⁻⁶（即百万分之一微生物存活的概率）。
基本原理：
1. 模拟最难灭菌点： 选择具有代表性的、灭菌剂最难穿透或最难发挥作用的载体（如金属片、滤纸条、导管腔、狭长缝隙模拟物、特定材质的厚布料等）。这些载体模拟了实际物品中最可能灭菌失败的区域(“冷点”)。
2. 引入高抗性微生物： 将已知数量、具有高度抵抗力的标准测试微生物（通常选用特定菌株的孢子）定量接种到这些载体上。这些孢子对灭菌因子的抵抗力远强于日常环境污染物和常见病原体。
3. 实施同步灭菌： 将接种了标准测试微生物的载体（即生物指示剂，BI）与待灭菌的实际物品一同放入灭菌设备内，经历完整的灭菌周期。
4. 培养与结果判定： 灭菌程序结束后，在严格控制的条件下复苏培养这些生物指示剂。通过观察是否有微生物生长，并结合初始接种量，科学判定该灭菌程序是否能有效杀灭最具抗性的微生物，从而推断其杀灭日常污染微生物的有效性。

三、核心要素

标准测试微生物 (挑战微生物)：
- 必须选择对特定灭菌方式具有高度固有抵抗力的微生物孢子。
- 常用代表菌株：
  - 湿热灭菌（蒸汽）： 嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus, ATCC 7953 或等同物) 孢子。对饱和蒸汽具有极强抵抗力。
  - 干热灭菌： 枯草芽孢杆菌黑色变种 (Bacillus atrophaeus, 旧称 Bacillus subtilis var. niger, ATCC 9372 或等同物) 孢子。对干热具有高度抵抗力。
  - 环氧乙烷 (EO) 灭菌： 枯草芽孢杆菌黑色变种 (Bacillus atrophaeus, ATCC 9372 或等同物) 孢子。
  - 过氧化氢等离子体/汽化过氧化氢灭菌： 嗜热脂肪地芽孢杆菌 (Geobacillus stearothermophilus, ATCC 7953 或等同物) 或特定抗性的萎缩芽孢杆菌 (Bacillus atrophaeus) 孢子。
  - 甲醛灭菌： 枯草芽孢杆菌黑色变种 (Bacillus atrophaeus, ATCC 9372 或等同物) 孢子。
- 要求： 孢子悬液应标准化，具备已知且稳定的抗力（通常用 D值和 Z值/F值表征）。使用前需确认活力。
载体：
- 材质和结构必须能够模拟实际灭菌物品中最难灭菌的特性（如不易被灭菌剂穿透、有吸附性、有保护性孔隙或管腔）。
- 不应显著影响灭菌因子的穿透和作用。
- 常用载体包括不锈钢片、玻璃片、滤纸片、特氟龙片、塑料管腔模拟装置、注射器针筒等。
- 载体本身必须无菌或易于灭菌。
生物指示剂 (BI) 形式：
- 孢子条/片： 孢子直接接种在载体（纸条、金属片、塑料片）上，是最常用形式，直接放入灭菌腔室或物品内部/最难灭菌位置。
- 自含式生物指示剂 (SCBI)： 将染有孢子的载体和装有复苏培养液的安瓿瓶密封在一个塑料管或玻璃管内。灭菌后无需无菌操作，直接压碎或激活内部培养液即可培养，使用方便且避免二次污染，尤其适用于现场监测。
- 接种在产品/模拟产品上： 直接将孢子接种到待灭菌产品的内部或最不易灭菌部位（需确认可行性和安全性）。
测试位置：
- 生物指示剂必须放置在灭菌设备腔室和灭菌装载物中预先确定的最难灭菌位置。这些位置通常通过物理验证（温度/压力/气体浓度探头）确定。
- 常规放置点包括：灭菌设备排水口上方、大包裹/容器的几何中心、紧密堆叠物品的中心、管腔器械的内腔、多层纺织物的夹层中等。
灭菌周期与参数：
- 测试必须在待验证的、完全确定的灭菌程序参数下进行（如温度、时间、压力、湿度、灭菌剂浓度、真空度、维持时间等）。这些参数应代表日常操作条件，并涵盖最差情况（如最大装载量）。

四、测试操作流程

准备：
- 根据标准选择正确的生物指示剂类型（孢子种类、载体、数量）。
- 确认生物指示剂在有效期内，并记录批号和孢子数量。
- 确定灭菌设备最难灭菌点及其放置方法。
- 准备未灭菌处理的阳性对照生物指示剂（同批次）。
- 准备培养基（根据生物指示剂要求）。
- 准备灭菌装载物（可以是实际物品，也可以是模拟负载）。
接种与放置：
- 将生物指示剂按照既定方案放置在灭菌设备腔室和装载物的最难灭菌位置（多个点）。
- 确保放置方式不影响灭菌剂的正常穿透和循环。
- 妥善固定以防止移位。
灭菌运行：
- 按照待验证的灭菌程序参数运行设备，完成整个灭菌周期。
- 详细记录运行参数（温度、压力、时间、浓度等）。
取出与转移：
- 灭菌程序结束后，在安全条件下取出生物指示剂（注意高温烫伤或灭菌剂残留风险）。
- 若使用非自含式BI，需在无菌条件下操作，避免二次污染。自含式BI相对安全。
培养：
- 自含式BI： 立即按说明书激活培养液（如压碎内管），放入设定好的培养设备（通常55-60°C 或 30-37°C，依菌种而定）。
- 非自含式BI： 在无菌条件下将载体转移至装有特定复苏培养液的试管中，然后放入培养设备。
- 阳性对照： 取同批次未灭菌的BI按相同方法培养。
- 阴性对照： 取一份未使用的培养基进行培养，确认无菌。
- 培养条件： 严格按照生物指示剂说明书要求的温度和时间进行培养（通常7天）。
结果观察与记录：
- 在培养期间（特别是在推荐的终点时间）定期观察培养基颜色变化（如使用含酸碱指示剂的培养基）或浑浊情况。
- 详细记录每个生物指示剂的培养起始时间、观察时间点和观察结果（生长/未生长）。
- 阳性对照必须显示生长，阴性对照必须显示无生长，否则试验无效。

五、结果判定

合格标准： 所有经过灭菌处理的生物指示剂在规定的培养时间内均没有显示微生物生长（培养基颜色不变或保持澄清）。
不合格： 任何一支经过灭菌处理的生物指示剂显示有微生物生长（培养基颜色变化或浑浊）。
注意： 结果判定需结合阳性对照和阴性对照的有效性。阳性对照长菌证明孢子具有活力，阴性对照不长菌证明操作无菌。

六、测试失败的应对

若测试失败：

立即暂停使用该灭菌程序处理关键物品。
彻底调查原因：
- 检查生物指示剂是否合格（运输、存储、操作有无问题？阳性对照是否长菌？）。
- 复核灭菌设备运行参数记录（温度/压力/时间/浓度是否达标？设备故障？）。
- 检查装载方式是否合理，是否阻碍了灭菌剂穿透？装载是否超载？
- 检查生物指示剂放置位置是否正确？是否移位？
- 检查灭菌剂质量或气体/蒸汽供应是否正常？
- 检查操作流程是否有误？
采取纠正措施： 根据调查结果修复设备、调整操作参数、优化装载方式、重新培训人员等。
重新验证： 在实施纠正措施后，必须重新进行完整的灭菌效果模拟使用测试（通常需要连续进行3次成功的测试）以证明问题已解决且灭菌程序恢复有效。

七、重要性与应用

法规符合性： 是满足国内外GMP、ISO 13485（医疗器械质量管理体系）、FDA、EPA等相关法规和标准对灭菌过程验证的强制性要求。
过程放行： 对于无菌产品（如植入器械、注射液）的生产，成功的灭菌验证是产品批次放行的前提之一。
设备与工艺确认： 新灭菌设备启用、灭菌程序重大变更（如改变装载方式、灭菌剂配方、参数调整）后，必须进行模拟使用测试以确认有效性。
周期性再验证： 即使日常运行正常，也需要定期（如每年或半年）进行模拟使用测试，以监控灭菌程序的持续有效性。
故障调查： 是查找灭菌失败根本原因的关键工具。
保证安全： 为患者、医护人员、实验人员和消费者提供最高级别的安全保障。

八、结论

灭菌效果模拟使用测试是灭菌工艺验证的核心和基石。它通过科学地模拟最恶劣的灭菌条件并使用已知高抗力微生物作为“挑战者”，为灭菌过程的可靠性和无菌保证水平提供最直接的客观证据。严格遵循标准化的操作流程、正确选择和使用生物指示剂、准确地放置于最难灭菌点、仔细地培养观察并科学地判定结果，是确保测试有效、结论可靠的关键。该测试对于保障生命安全、确保产品质量合规、维护工艺稳健性具有不可替代的重要作用。所有依赖灭菌过程的机构都应将其作为质量控制体系中的关键环节予以高度重视和严格执行。