灭菌物品微生物挑战测试

微生物挑战测试：验证无菌屏障微生物挑战测试：验证无菌屏障的关键

引言
在医疗、制药、生物技术及食品等领域，确保产品无菌至关重要。灭菌物品微生物挑战测试（也称为灭菌验证中的微生物学部分或生物指示剂挑战测试）是评估和确认灭菌工艺有效性的核心科学方法。它直接模拟灭菌过程对最具抗性微生物的杀灭能力，为产品达到规定的无菌保证水平提供关键证据。

一、 核心目的与重要性

1. 验证灭菌工艺有效性： 证明在既定的灭菌参数（如时间、温度、浓度、剂量）下，工艺能稳定、可重复地杀灭或去除产品上或内部的微生物，达到预定的无菌保证水平。
2. 确定灭菌工艺的“杀灭能力”： 量化灭菌工艺对特定微生物的杀灭效果，通常通过计算生物指示剂的杀灭对数下降值或无菌对数下降值或无菌试验结果来体现。
3. 评估产品设计的影响： 考察产品本身（材料、结构、包装、装载方式）对灭菌剂（如蒸汽、环氧乙烷、辐射）渗透、扩散或能量传递的影响，识别潜在的灭菌难点区域。
4. 满足法规与标准要求： 是国内外药品生产质量管理规范、医疗器械质量管理体系以及相关国际标准（如ISO 11135, ISO 11137, ISO 17665, ISO 13408, USP <1229>等）的强制性要求。
5. 保障患者与使用者安全： 最终目标是确保投放市场的灭菌产品在使用时是安全无菌的，最大限度降低因微生物污染导致的感染风险。

二、 基本原理

该测试基于以下核心原则：

1. 过度杀灭法： 使用已知高浓度、高抗性的标准生物指示剂（BI）接种到产品或模拟产品/载体上，挑战灭菌工艺的极限能力。证明在最差条件下（如最难灭菌位置、最小灭菌剂量/参数），BI也能被完全杀灭。
2. 生物指示剂法： 利用对特定灭菌方式具有高度抗性的标准微生物孢子（如湿热灭菌用嗜热脂肪地芽孢杆菌、环氧乙烷灭菌用枯草杆菌黑色变种、辐照灭菌用短小芽孢杆菌）作为挑战微生物。这些孢子比产品上可能存在的自然微生物群落更难杀灭。
3. 半周期法： 在灭菌验证中常用。通过运行一个比常规灭菌周期时间/剂量减半的周期，证明在此条件下能完全杀灭高浓度的BI，从而推断全周期具有极大的安全边际（通常提供至少10^-6的无菌保证水平）。
4. 无菌保证水平： 目标是将非无菌单元的概率降低到可接受的低水平（如10^-6，即百万分之一）。微生物挑战测试是证明达到SAL的关键手段。

三、 关键步骤与方法

1. 定义目标与标准：

   • 明确待验证的灭菌工艺类型（EO, 辐照, 湿热, 干热等）。
   • 确定要求的无菌保证水平。
   • 选择适用的国际/国家/行业标准。
   • 定义可接受的测试标准（如BI全部杀灭，无菌试验阴性）。

2. 选择与准备生物指示剂：

   • 菌种： 必须选择经认可、对目标灭菌方式具有标准抗性的菌株（D值已知且稳定）。
   • 载体： 可以是标准载体（滤纸条、不锈钢片）或产品本身/产品最难灭菌部位（首选，最真实）。对于复杂产品，需识别并挑战“最难灭菌位置”。
   • 接种量： 接种高浓度的孢子悬液（通常≥10^6 CFU/单位），确保提供足够的挑战。
   • 质量控制： BI在使用前必须进行活菌计数（确认接种量）和纯度检查。

3. 样品制备与装载：

   • 将接种了BI的产品/载体单元（挑战单元）和未接种的对照单元（用于无菌试验）按最差装载方式（模拟实际生产中最不利于灭菌剂穿透或能量传递的装载模式）放入灭菌室内。
   • 在灭菌室内最难灭菌位置（基于热分布/穿透或剂量分布研究确定）放置挑战单元。
   • 设置阳性对照（未灭菌的接种BI单元）和阴性对照（未接种、未灭菌的培养基单元）。

4. 执行灭菌过程：

   • 在最小灭菌参数（如最低温度、最短时间、最低浓度、最低剂量）下运行灭菌周期。这是为了挑战工艺的“最差情况”。
   • 严格监控并记录所有关键灭菌参数。

5. 培养与结果判读：

   • 生物指示剂培养： 灭菌后，取出挑战单元中的BI，在规定的条件下（特定培养基、温度、时间）进行培养。观察是否有微生物生长。
   • 无菌试验： 对灭菌后的未接种对照单元（即实际产品）进行无菌检查（通常依据药典方法，如USP <71>），作为附加证据。
   • 对照检查：
     • 阳性对照： 必须显示微生物生长，证明BI是活的且培养条件适宜。
     • 阴性对照： 必须显示无菌生长，证明培养基无菌且操作无污染。
     • BI数量对照： 确认初始接种量符合要求。

6. 结果判定：

   • 主要成功标准： 所有经过灭菌处理的生物指示剂单元在培养后必须显示无生长（阴性）。
   • 附加证据： 无菌试验结果应全部为阴性（尽管BI挑战是主要依据）。
   • 对照符合要求： 所有对照结果必须符合预期。
   • 计算杀灭效果： 根据初始BI数量和杀灭结果，计算杀灭对数值。通常要求达到至少6个对数下降值（对应SAL 10^-6）。

四、 常用生物指示剂菌种

五、 关键考虑因素与挑战

1. “最难灭菌位置”的确定： 需要结合产品设计、包装、装载方式以及灭菌剂/能量分布研究（热分布/穿透、剂量分布、气体分布）来科学识别。这是测试成功的关键。
2. 生物指示剂的选择与质量： BI的D值、纯度、稳定性、储存条件直接影响测试结果可靠性。必须使用合格供应商提供的、经过严格质控的BI。
3. 接种技术与均匀性： 确保BI孢子均匀、牢固地接种到产品最难灭菌部位，且接种量准确可控。
4. 最差条件模拟： 必须确保测试：** 必须确保测试是在工艺参数的下限、装载的最差状态、产品/包装的最大挑战状态下进行。
5. 培养条件控制： 严格按照BI制造商或标准要求进行培养，避免假阴性或假阳性结果。
6. 无菌操作： 整个测试过程（接种、转移、培养）必须在严格的无菌条件下进行，防止外源性污染干扰结果。
7. 数据记录与可追溯性： 所有操作步骤、参数、结果必须详细、准确记录，确保可追溯性。

六、 常见问题与注意事项

• 假阴性： BI未生长，但可能由于培养条件不当、BI失活、操作失误导致，而非灭菌有效。严格对照可帮助识别。
• 假阳性： BI生长，但可能由于灭菌后污染、操作污染、阳性对照污染导致，而非灭菌无效。严格无菌操作和阴性对照至关重要。
• BI复苏： 灭菌后受损的孢子可能在培养后期生长，需按标准规定培养足够时间。
• 产品影响： 某些产品材料可能吸附灭菌剂或影响其活性，或释放抑制微生物生长的物质，需在方法开发时考虑。
• 生物安全： 操作高浓度微生物孢子必须遵守生物安全规定，在适当等级的实验室（通常BSL-2）进行，使用生物安全柜等防护设备。

**七安全柜等防护设备。

七、 结论

灭菌物品微生物挑战测试是确保灭菌工艺可靠性和最终产品无菌性的科学基石。最终产品无菌性的科学基石。它通过在最苛刻的条件下，使用最具抗性的标准微生物对灭菌工艺进行直接挑战，为达到法规要求的无菌保证水平提供了最有力的实验证据。严谨的设计、规范的操作、准确的判读以及对关键影响因素的控制，是保证测试结果有效、可靠、具有说服力的有效、可靠、具有说服力的核心。该测试不仅是合规要求，更是保障患者和消费者生命安全、维护产品质量信誉不可或缺的关键环节。持续的工艺监控和定期的再验证，确保灭菌效果在整个产品生命周期内保持稳定可靠。