单侧输尿管结扎 (UUO) 大鼠肾间质纤维化模型：检测项目详解
摘要： 单侧输尿管结扎 (UUO) 是研究肾间质纤维化 (RIF) 的经典动物模型，可模拟进行性肾损伤的核心病理过程。本文将系统阐述 UUO 模型建立后，评估肾间质纤维化程度及机制的核心检测项目，涵盖组织形态学、分子生物学、生化指标及功能学层面，为研究者提供全面的技术参考。
一、模型简介 UUO 手术通过结扎大鼠单侧输尿管中上段，造成肾盂积水、肾小管内压增高、肾小管上皮细胞损伤，进而触发强烈的炎症反应、肌成纤维细胞活化、细胞外基质 (ECM) 过度沉积，最终导致不可逆的肾间质纤维化。对侧肾脏作为自身对照，是模型的重要优势。
二、核心检测项目 (重点)
检测项目的选择需紧密围绕 RIF 的核心特征：肾小管损伤/萎缩、炎症细胞浸润、肌成纤维细胞活化增殖、ECM 过度沉积与重塑。
1. 组织形态学与病理学评估 (金标准)
- 苏木素-伊红 (H&E) 染色：
- 目的： 评估整体肾脏结构、肾小管损伤（扩张、萎缩、扁平化、管型）、炎症细胞浸润程度及分布。
- 关键指标： 肾小管损伤评分 (Tubular Injury Score, TIS)，炎症浸润评分。
- Masson 三色染色 (Masson’s Trichrome)：
- 目的： 特异性显示胶原纤维沉积 (呈蓝色或绿色)，直观评估肾间质纤维化面积和程度。
- 关键指标： 肾间质纤维化面积百分比 (Collagen Volume Fraction, CVF) - 通过图像分析软件定量分析染色的蓝色/绿色区域占肾皮质或整个视野面积的百分比。这是评估纤维化最常用的形态学定量指标。
- 天狼星红染色 (Sirius Red Staining)：
- 目的： 特异性染色胶原 (I型和III型为主，呈红色或黄色/橙色)，在偏振光下可区分胶原类型（I型：强双折射，呈黄/橙色；III型：弱双折射，呈绿色）。
- 关键指标： 同 Masson 染色，计算 胶原阳性面积百分比。偏振光下可半定量分析 I/III 型胶原比例。
- 过碘酸-雪夫染色 (PAS)：
- 目的： 突出显示肾小球基底膜、肾小管基底膜 (蓝色或紫色) 和管型，辅助评估肾小管结构完整性。
- 免疫组织化学 (IHC) / 免疫荧光 (IF)：
- 目的： 在组织原位精确定位和半定量特定蛋白的表达水平及细胞定位。
- 关键靶点 (示例)：
- 肌成纤维细胞标志物： α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) - 活化的肌成纤维细胞核心标志物。
- ECM 成分： 胶原 I (Col I), 胶原 III (Col III), 纤连蛋白 (Fibronectin, FN)。
- 上皮-间质转化 (EMT) 标志物： E-钙黏蛋白 (E-cadherin, 上皮标志，表达下降)，波形蛋白 (Vimentin, 间质标志，表达上升)，S100A4 (FSP-1)。
- 炎症细胞标志物： CD68 (巨噬细胞), F4/80 (小鼠巨噬细胞), CD3 (T细胞), MPO (中性粒细胞)。
- 促纤维化因子： 转化生长因子-β1 (TGF-β1) - 最关键的促纤维化因子，磷酸化 Smad2/3 (p-Smad2/3, TGF-β 下游信号)。
- 损伤/应激标志物： 肾损伤分子-1 (KIM-1), 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (NGAL)。
- 关键指标： 阳性染色面积百分比、染色强度评分 (如 H-score)、阳性细胞计数。
2. 分子生物学检测 (基因与蛋白水平)
- 实时荧光定量 PCR (qRT-PCR)：
- 目的： 定量检测目标 mRNA 的表达水平，反映基因转录活性。
- 关键靶基因 (示例)：
- 促纤维化因子： Tgfb1, Ctgf (结缔组织生长因子), Pai-1 (纤溶酶原激活物抑制剂-1)。
- ECM 合成相关： Col1a1, Col3a1, Fn1 (纤连蛋白)。
- ECM 降解酶/抑制剂： Mmp2, Mmp9 (基质金属蛋白酶), Timp1 (金属蛋白酶组织抑制剂)。
- 肌成纤维细胞标志物： Acta2 (α-SMA), Tagln (SM22α)。
- 炎症因子： Tnf-α, Il-1β, Il-6, Mcp-1 (CCL2)。
- 损伤标志物： Havcr1 (KIM-1), Lcn2 (NGAL)。
- 关键指标： 目标基因 mRNA 表达相对于内参基因 (如 Gapdh, β-actin) 的倍数变化 (常以 Sham 组为基准)。
- 蛋白质印迹 (Western Blot)：
- 目的： 定量检测组织中特定蛋白的表达水平和翻译后修饰状态。
- 关键靶蛋白 (示例)： α-SMA, Col I, FN, TGF-β1, p-Smad2/3, Smad7 (TGF-β 负调控因子), MMP2, MMP9, TIMP1, KIM-1, NGAL, 炎症因子蛋白等。
- 关键指标： 目标蛋白条带灰度值相对于内参蛋白 (如 β-actin, GAPDH) 的比值。
- 酶联免疫吸附试验 (ELISA)：
- 目的： 定量检测血清、尿液或肾组织匀浆上清液中可溶性蛋白因子 (如细胞因子、趋化因子、损伤标志物) 的浓度。
- 关键靶标 (示例)： TGF-β1 (注意检测活性形式), TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1, KIM-1, NGAL, FN (片段) 等。
- 关键指标： 目标蛋白的绝对浓度 (pg/ml 或 ng/ml)。
3. 生化指标检测
- 血清肌酐 (Scr) 和尿素氮 (BUN)：
- 目的： 评估 整体肾功能。
- 注意： 在 UUO 模型中，由于对侧健康肾脏的代偿，Scr 和 BUN 在早期和中期通常不升高或仅轻度升高。显著升高常提示晚期严重病变或对侧肾也受累。主要反映模型成功和终末期改变。
- 尿液指标：
- 尿蛋白/肌酐比值 (UPCR)： 评估肾小球滤过屏障损伤程度。UUO 中可能轻度升高，但非主要病变。
- 尿 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 (NAG)： 反映近端肾小管上皮细胞损伤的敏感指标。
- 尿 KIM-1, NGAL： 高度特异性的肾小管损伤早期标志物 (也可在组织或血清中检测)。
4. 功能学与特殊检测 (按需)
- 肾功能动态监测： 如菊粉清除率 (Cin) 或同位素标记物检测肾小球滤过率 (GFR)。因技术复杂，在 UUO 中应用较少，对侧代偿使其意义受限。
- 氧化应激指标： 检测肾组织匀浆中丙二醛 (MDA, 脂质过氧化产物)、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性等，评估氧化应激在纤维化中的作用。
- 细胞凋亡检测：
- TUNEL 染色： 在组织原位标记凋亡细胞核。
- Caspase-3 (活性或裂解形式) 检测 (WB/IHC)： 关键凋亡执行蛋白。
- 离体肾小管灌注/原代细胞培养： 深入研究特定细胞类型（如肾小管上皮细胞、成纤维细胞）在纤维化中的具体机制（超出基础检测范畴）。
三、检测策略建议
- 必做核心项目： H&E, Masson/Sirius Red (定量 CVF), IHC/IF for α-SMA (定量)。 这是评估纤维化程度和组织学改变的基石。
- 深入机制探索：
- qRT-PCR/WB/ELISA for TGF-β1 及其下游信号 (Smad2/3磷酸化)、关键 ECM (Col I, FN)、炎症因子 (TNF-α, IL-1β, MCP-1)。 解析核心促纤维化通路。
- IHC/IF for 巨噬细胞标志物 (CD68/F4/80)、T细胞标志物 (CD3)。 评估炎症浸润。
- 检测肾小管损伤标志物 (KIM-1, NGAL - 组织或血清/尿)。 评估损伤源头。
- 时间点选择： UUO 后纤维化进展迅速。常见检测时间点：术后 3、7、14 天。 3天可见明显炎症和早期损伤，7天纤维化显著进展，14天达到平台期/严重纤维化。根据研究目的选择。
- 样本处理：
- 组织分切：一部分立即液氮速冻，存于-80°C，用于分子生物学检测 (RNA, Protein)。
- 一部分用 4% 多聚甲醛固定，用于石蜡包埋和后续切片染色 (H&E, Masson, Sirius Red, IHC)。
- 固定组织也可用于 IF（需特定固定剂如PFA，避免过度交联）。
- 收集血清、尿液分装冻存于-80°C，用于生化及ELISA检测。
- 定量化与统计学： 尽可能采用图像分析软件对组织学染色 (CVF, IHC/IF阳性面积/强度) 进行定量分析，并结合分子生物学和生化的定量数据，使用恰当的统计学方法进行比较分析。设置合理的 Sham 手术组 作为对照至关重要。
四、总结 在 UUO 诱导的大鼠肾间质纤维化研究中，系统性地组合应用上述检测项目，能够全面、多层次地揭示纤维化的发生、发展过程及其分子机制。组织形态学 (尤其胶原染色定量) 和肌成纤维细胞标志物 (α-SMA) 检测是评估纤维化程度的金标准。 结合 TGF-β 通路、ECM 代谢、炎症反应和肾小管损伤等关键分子事件的检测，可深入阐释药物干预或基因操作的作用靶点和疗效，为理解肾纤维化病理和开发抗纤维化策略提供坚实依据。研究者应根据具体科学问题和资源，合理选择和优化检测组合。
参考文献 (示例，需根据实际引用更新):
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., & Thornhill, B. A. (2009). Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney international, 75(11), 1145-1152.
- Eddy, A. A. (2014). Overview of the cellular and molecular basis of kidney fibrosis. Kidney International Supplements, 4(1), 2-8.
- Grande, M. T., & López-Novoa, J. M. (2009). Fibroblast activation and myofibroblast generation in obstructive nephropathy. Nephron Experimental Nephrology, 113(3), e97-e106.
- Liu, Y. (2011). Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nature Reviews Nephrology, 7(12), 684-696.