低温灭菌生物指示剂抗力测试详解
在低温灭菌技术（如环氧乙烷灭菌、过氧化氢等离子体灭菌、蒸汽甲醛灭菌等）广泛应用于医疗器械再处理的过程中，生物指示剂（BI）是验证灭菌过程有效性的核心工具。其核心性能——抗力（对灭菌因子的耐受能力），必须通过严格的标准化测试进行确认，这就是生物指示剂抗力测试的意义所在。
一、生物指示剂的核心作用与构成
- 作用原理： 生物指示剂内含已知高抗力、高浓度的标准微生物孢子悬液（通常为嗜热脂肪地芽孢杆菌 Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 或枯草芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus ATCC 9372）。将其置于灭菌器最难灭菌的位置，灭菌后通过培养检测孢子是否被杀灭，从而直接反映灭菌过程是否达到微生物学上的保障水平（SAL）。
- 核心构成：
- 载体： 承载孢子的基质（如滤纸片、不锈钢片、塑料片等），须符合相关标准（如 ISO 11138-1）。
- 孢子悬液： 高浓度、高纯度、高抗力且稳定的标准孢子（如 G. stearothermophilus）。
- 培养基： 复苏培养孢子用的营养液体培养基（如胰酪大豆胨液体培养基 TSB）。
- 外壳/容器： 保护载体和孢子，允许灭菌剂穿透（如玻璃安瓿、塑料管、自含式外壳）。
二、抗力测试的核心目标
抗力测试旨在量化评估生物指示剂对特定灭菌因子（如特定浓度的环氧乙烷、特定条件的过氧化氢等离子体）的耐受能力，确定其关键性能参数：
- D值： 在特定灭菌条件下，杀灭90%的测试微生物所需的时间（或剂量）。是衡量抗力强弱的直接指标。
- 存活时间： 在特定灭菌条件下，所有测试样本中均有孢子存活的最短处理时间。
- 杀灭时间： 在特定灭菌条件下，所有测试样本中孢子均被杀灭的最短处理时间。
- 孢子浓度： 生物指示剂所含活性孢子的数量（通常以 CFU/载体 表示），需达到规定要求（如 ≥ 1 × 10⁶ CFU）。
- 稳定性： 在规定的储存条件下，上述抗力参数在规定有效期内的保持能力。
三、抗力测试的标准流程与方法
抗力测试必须依据国际或国家认可的严格标准进行，核心标准是 ISO 11138 系列（特别是 ISO 11138-1：通则 和 针对具体灭菌方式的后续部分，如 ISO 11138-2：环氧乙烷灭菌）。基本流程如下：
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测试菌株准备：
- 使用标准菌株（如 G. stearothermophilus ATCC 7953）。
- 按照标准方法进行培养、纯化、孢子收获、清洗和标准化悬浮液制备。
- 确保孢子悬液达到高纯度（≥ 97%）、高浓度（通常 ≥ 1 × 10⁹ CFU/mL）和高抗力。
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接种载体：
- 将标准化的孢子悬液定量接种到指定的载体上（如精确滴加定量体积）。
- 严格控制环境条件（如温度、湿度）以避免污染。
- 采用温和方法干燥载体（如真空干燥、风干），避免孢子损伤。
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抗力测定仪准备：
- 使用经过严格验证的特制抗力测定仪（Resistometer）。
- 该仪器能精确控制灭菌关键参数（如气体浓度、温度、湿度、压力、暴露时间/剂量等）。
- 确保仪器性能稳定、均匀性好、可重复性高，且在有效校准期内。
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分装对照组：
- 阳性对照组： 接种载体不经灭菌处理，直接培养，确认孢子活性（应100%生长）。
- 阴性对照组： 未接种的载体或空白培养基一同培养，确认无菌状态（应无生长）。
- 回收率计数组： 接种载体不经灭菌处理，用标准方法洗脱孢子并进行活菌计数，确定初始接种量（应与目标浓度一致）。
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抗力暴露测试：
- 将装有接种载体的测试单元（如安瓿瓶、管）放置于抗力测定仪中。
- 关键： 设定一系列递增的灭菌暴露时间（或剂量）。通常选择6-10个时间点，覆盖从部分杀灭到完全杀灭的范围。
- 在每个时间点下，处理足够数量的重复样本（通常每个时间点≥ 20个载体）。
- 暴露完成后，立即中和残留灭菌剂并终止灭菌过程（如需）。
- 严格按照标准操作程序转移样本。
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培养与结果判定：
- 将暴露后的载体无菌转移至含培养基的试管中。
- 在指定的温度和时间内培养（如 G. stearothermophilus 在55-60℃下培养7天）。
- 定期观察培养基浊度变化或颜色变化（如含指示剂）。浊度/变色=生长（阳性）；澄清/不变色=无生长（阴性）。
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数据分析与参数计算：
- 统计每个暴露时间点下的阳性样本数（有生长）和阴性样本数（无生长）。
- 存活时间 (ST)： 所有测试样本均为阳性的最长暴露时间。
- 杀灭时间 (KT)： 所有测试样本均为阴性的最短暴露时间。
- D值计算：
- 常用方法包括部分阴性法和Stumbo-Murphy-Cochran (SMC)法。
- 部分阴性法： 选取能产生部分阴性（部分阳性）结果的时间点。D值 = (暴露时间差值) / log(起始阳性数) - log(残留阳性数)。
- SMC法： 利用所有时间点的阳性和阴性数据，通过数学模型（如Probit分析）拟合存活曲线，斜率倒数即为D值。这是更精确、更常用的方法。
- 孢子浓度确认： 回收率计数组的平均活菌数即为该批次生物指示剂的标称孢子浓度。必须在规定范围内（如 ≥ 1 × 10⁶ CFU/载体）。
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稳定性监测：
- 生产的生物指示剂需在规定的储存条件下（温度、湿度）定期抽样。
- 重复上述抗力测试流程（通常测试D值、孢子浓度）。
- 确认在整个宣称的有效期内，抗力参数（D值）和孢子浓度均保持在可接受的限定范围内，符合标签声明。
四、抗力测试的核心意义与应用
- 灭菌过程验证的关键： 生物指示剂的标准抗力（尤其是D值）是灭菌工艺开发和验证（如半周期法）的科学基础。用户依据BI的抗力来设定灭菌参数以达到SAL。
- 批次放行的依据： 制造商必须对每一生产批次的BI进行抗力测试，确保其符合规定标准（如D值范围、孢子浓度范围），方可投放市场。
- 质量一致性的保证： 定期抗力测试（包括稳定性测试）监控生产工艺的一致性，确保不同批次BI性能稳定可靠。
- 灭菌效果监测： 日常灭菌负荷中包含BI，其结果直接反映当次灭菌循环是否有效（阳性对照需生长，测试BI需无菌生长）。
- 符合法规要求： FDA、CE认证以及各国药典（如USP）都明确规定用于灭菌验证的BI必须通过标准化的抗力测试。
五、关键考量因素
- 标准化： 严格遵循ISO或等效国家标准是结果可比性和可靠性的根本保证。
- 仪器校准： 抗力测定仪的温度、气体浓度、湿度、压力等传感器必须定期进行高精度校准。
- 环境控制： 实验室环境（洁净度、温湿度）和操作规范（无菌技术）至关重要，避免污染。
- 数据分析严谨性： D值计算应采用公认的统计方法，结果需有统计学意义。
- 记录与追溯： 测试过程的每个细节（菌种传代、孢子制备、接种量、暴露参数、培养观察、计算结果等）都必须完整、准确、可追溯地记录。
六、结论
低温灭菌生物指示剂的抗力测试是一项高度专业化、标准化的核心质量控制活动。通过严格的菌种管理、标准化操作、精密仪器控制、科学的统计分析和稳定性监测，确保每一支生物指示剂都具备已知且稳定的抗力特性。这些特性是医疗器械低温灭菌工艺得以科学验证、有效监控并最终确保患者安全的基石。持续遵循国际标准、确保测试过程的严谨性和数据的可靠性，对于维护医疗灭菌领域的质量和安全至关重要。
重要提示：
- 本文内容基于通用科学原理和国际标准（如ISO 11138系列），不涉及任何特定企业的产品或流程细节。
- 实际操作应严格遵循现行有效的国际标准（ISO）、国家法规以及制造商提供的说明书。
- 处理微生物孢子时须遵守生物安全规范。