寡核苷酸序列分析

发布时间：2025-06-11 16:24:12 阅读量：8 作者：生物检测中心

寡核苷酸序列分析：技术与应用

一、引言

寡核苷酸（Oligonucleotide）是指由20个以内核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的短链核酸分子（包括DNA和RNA）。作为分子生物学、遗传学、诊断学和治疗学等领域不可或缺的基础工具，其序列信息的准确性至关重要。寡核苷酸序列分析（Oligonucleotide Sequence Analysis）即是通过一系列实验和计算方法，精确测定这些短核酸分子的核苷酸排列顺序的过程。

二、寡核苷酸序列分析的核心技术

寡核苷酸序列分析技术的发展经历了从传统方法到高通量、高精度现代技术的演变：

  1. 传统分析方法：

    • 凝胶电泳法： 早期结合化学降解（Maxam-Gilbert法）或酶促降解（Sanger双脱氧链终止法）对标记的寡核苷酸进行测序，通过电泳条带位置判读序列。适用于较短序列（<50 nt），但通量低、操作繁琐。
    • 质谱法（MS）：
      • 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）： 通过精确测量寡核苷酸分子离子或其酶解片段的质量，推断其组成甚至序列（尤其适用于已知库中的验证或短序列从头测序）。速度快，灵敏度高。
      • 电喷雾电离质谱（ESI-MS）： 可提供更高质量精度和分辨率，适用于更长的寡核苷酸和修饰分析。
    • 高效液相色谱法（HPLC）： 反相HPLC（RP-HPLC）或离子对HPLC（IP-RP-HPLC）常用于分离和分析寡核苷酸混合物，基于疏水性差异。结合酶解或化学降解，可通过分析降解产物的洗脱时间推断序列信息（如杂交分析、错配检测）。

  2. 现代测序技术：

    • 第二代测序技术（NGS）： 虽然主要用于长片段测序，但通过特殊的文库制备方法（如将寡核苷酸连接至通用接头）或使用超高深度测序，可实现对大量寡核苷酸池（如引物库、探针库、寡核苷酸药物库）的高通量并行测序。通量极高，成本相对较低。
    • 单分子测序技术：
      • 单分子实时测序（SMRT）： 利用零模波导孔实时监测DNA聚合酶在合成互补链时掺入荧光标记核苷酸的过程，读长长，对某些修饰敏感。
      • 纳米孔测序： 当单个DNA/RNA分子通过纳米尺度的蛋白质孔或固态孔时，引起特征性的离子电流变化，通过算法解码电流信号获得序列信息。可直接读取RNA序列和部分修饰。
    • 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）： 一种基于酶级联反应的合成测序法。在DNA聚合酶依次掺入互补核苷酸时释放焦磷酸（PPi），PPi通过后续酶促反应转化为光信号。特别适合已知序列区域的短片段（如SNP分型）分析，准确性高。
    • 杂交测序（SBH）： 利用大量已知短序列探针与目标寡核苷酸杂交，通过杂交信号模式重建目标序列。通常需要高密度芯片或微阵列平台。

三、寡核苷酸序列分析的关键环节与挑战

  1. 样品制备： 高纯度样品是准确分析的基础。常用纯化方法包括脱盐、HPLC纯化、凝胶电泳回收等。对于修饰寡核苷酸，需特别注意避免降解。
  2. 数据处理与生物信息学分析： 现代技术（尤其是NGS和纳米孔）产生海量数据，需要强大的生物信息学工具进行：
    • 碱基识别（Base Calling）： 将原始信号（荧光、电流等）转换为核苷酸序列。
    • 序列比对（Alignment）： 将测得序列与设计序列或参考序列进行比对。
    • 变异检测： 识别单核苷酸变异（SNV）、插入（Insertion）、缺失（Deletion）等错误。
    • 修饰检测： 分析特定测序技术（如SMRT、纳米孔）产生的信号异常，推断碱基修饰（如甲基化）。
    • 质量评估（QA/QC）： 计算序列质量值（Q值）、错误率、一致性等指标评估数据可靠性。
  3. 挑战：
    • 同聚物区域（Homopolymer Regions）： 连续相同碱基（如AAAA）在Sanger法、焦磷酸测序和某些NGS平台上易出现插入/缺失错误。质谱法和纳米孔测序在此方面表现相对较好。
    • 二级结构： 富含GC或具有复杂二级结构的寡核苷酸可能影响测序效率（如聚合酶停顿）或杂交效率。
    • 化学修饰： 硫代磷酸酯、2'-O-甲基化、锁核酸（LNA）、肽核酸（PNA）等治疗性寡核苷酸中常用的修饰，可能干扰传统酶促反应或改变物理化学性质，需采用特定方法（如质谱、修饰兼容的测序技术）分析。
    • 痕量分析： 在诊断或环境样本中，目标寡核苷酸可能浓度极低，需要高灵敏度的检测方法（如数字PCR结合测序）。

四、寡核苷酸序列分析的应用

寡核苷酸序列分析的应用极其广泛：

  1. 合成寡核苷酸的质量控制： 这是最核心的应用。确保合成的引物、探针、基因片段、适配体（Aptamer）、反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、CRISPR引导RNA（gRNA）等序列与设计完全一致，不含错误（缺失、插入、错配、截短）。
  2. 分子诊断：
    • 病原体检测： 设计特异性探针或引物，通过测序确认其序列及特异性。
    • 遗传病筛查： 利用等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针进行突变检测，需验证探针序列准确性。
    • 液体活检： 分析循环肿瘤DNA（ctDNA）中的特定突变，依赖于高特异性的捕获探针或扩增引物。
  3. 基础研究：
    • 引物验证： PCR、测序等实验所用引物序列必须准确无误。
    • 探针验证： 用于FISH、微阵列、Northern/Southern blot等的探针需确认序列。
    • 功能基因组学： 高通量筛选（如RNAi筛选、CRISPR筛选）中使用的寡核苷酸库（siRNA库、sgRNA库）需要严格的质量控制以确保库的完整性和代表性。
  4. 治疗性寡核苷酸开发： 反义寡核苷酸（ASO）、siRNA、适体（Aptamer）等寡核苷酸药物的序列是其发挥功能的基础。在研发、生产（CMC）和质量放行（Release Testing）的各个环节都必须进行严格的序列确认和杂质分析（如缺失链、截短链）。
  5. 法医学与溯源： 分析特定设计的寡核苷酸标签或条形码序列，用于样本追踪或产品防伪。

五、质量保证与标准

为确保分析结果的可靠性和可比性，寡核苷酸序列分析需遵循严格的质量保证（QA）和质量控制（QC）流程：

  • 建立标准操作程序（SOP）。
  • 使用经过认证的标准品进行方法验证和校准。
  • 实施内部质量控制（IQC），如设置阳性/阴性对照、重复测试。
  • 参与能力验证（PT）或实验室间比对。
  • 数据需满足预设的接受标准（如序列一致性 ≥99%、主要峰比例等）。

六、结论

寡核苷酸序列分析是保障生命科学研究和生物技术应用准确性的基石。随着合成寡核苷酸（尤其在治疗领域）需求的爆炸性增长以及对分析精度、通量和速度要求的不断提高，该领域的技术也在持续快速发展。质谱技术因其速度、灵敏度和对修饰的分析能力占据重要地位；NGS技术提供了无与伦比的通量；而纳米孔和SMRT等单分子技术则在直接读取修饰和长读长方面展现出潜力。未来，自动化、集成化（“样本进-结果出”）的分析平台，结合更强大的人工智能算法进行数据处理和解读，将是重要发展方向。无论技术如何演进，精确、可靠地获取寡核苷酸的序列信息，始终是其成功应用的前提。