灭菌固体产品微生物检测完整指南
灭菌固体产品（如注射用粉末、无菌器械、植入物等）需通过严格的微生物检测确保其无菌性及生物负荷符合要求。以下为完整检测流程与技术要点：
一、 检测目的
- 无菌检查： 确认产品是否存在存活微生物（强制性要求）。
- 微生物限度检查： 定量检测非灭菌产品/原料中的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数（适用时）。
- 方法适用性试验： 验证所用检测方法能准确检出产品中可能存在的微生物。
二、 法规与标准依据
- 《中华人民共和国药典》通则 <1101> 无菌检查法、<1105> 非无菌产品微生物限度检查、<1106> 控制菌检查法
- ISO 11737-1: 医疗保健产品灭菌 - 微生物学方法 - 第1部分：产品上微生物总数的测定
- GMP（药品生产质量管理规范）附录《无菌药品》
三、 检测环境与设备要求
- 洁净环境：
- 无菌检测须在 B级背景下的A级单向流空气区（如超净工作台/隔离器）内进行。
- 微生物限度检查通常在 C级或D级 洁净环境进行。
- 定期进行环境悬浮粒子、沉降菌、浮游菌、表面微生物监控并符合标准。
- 关键设备：
- 生物安全柜/超净工作台/隔离器： 提供A级操作环境。
- 高压蒸汽灭菌器/干热灭菌器： 用于培养基、稀释剂、器材灭菌。
- 恒温培养箱： 精确控制培养温度（需氧培养：30-35°C；真菌培养：20-25°C）。
- 薄膜过滤装置： 适用于大多数灭菌固体产品的无菌检查。
- 均质器/振荡器： 用于固体样品分散（微生物限度）。
- 验证合格的微生物鉴定系统。
四、 培养基与试剂
- 无菌检查：
- 硫乙醇酸盐流体培养基 (FTM)： 用于培养需氧菌、厌氧菌（主用于细菌）。
- 胰酪大豆胨液体培养基 (TSB)： 用于培养需氧菌、真菌。
- 微生物限度检查：
- 胰酪大豆胨琼脂培养基 (TSA)： 测定需氧菌总数。
- 沙氏葡萄糖琼脂培养基 (SDA)： 测定霉菌和酵母菌总数。
- 稀释液： 如pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液。
- 培养基质量控制：
- 每批培养基必须进行 无菌性检查 和 促生长试验。
- 按药典要求定期进行灵敏度检查。
五、 样品前处理
- 无菌检查：
- 溶解/悬浮： 用无菌稀释剂溶解或充分悬浮样品。
- 转移： 无菌操作将溶液/悬浮液转移至薄膜过滤装置或直接接种培养基（如适用）。
- 冲洗： 薄膜过滤法需用足量无菌稀释液冲洗滤膜（通常≥100ml/膜，需验证），去除抑菌性。
- 微生物限度检查：
- 称量： 无菌条件下准确称取规定量样品。
- 稀释/分散： 加入预热的无菌稀释液，采用均质、振荡或超声等方法充分分散样品，制成1:10供试液。
- 梯度稀释： 根据预期污染水平进行10倍系列稀释。
六、 检测方法
(一) 无菌检查法 (薄膜过滤法为主)
- 操作：
- 将样品溶液/悬浮液通过孔径≤0.45 µm的 无菌滤膜。
- 用无菌稀释液充分冲洗滤膜（去除残留样品及可能的抑菌成分）。
- 将滤膜转移至装有FTM和TSB培养基的容器中（或直接剪膜加入）；或采用全封闭式集菌培养器。
- 同时进行 阴性对照 和 阳性对照（分别接种<100CFU的金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉）。
- 培养：
- FTM管：培养14天，温度30-35°C。培养前3天观察并记录，后续定期观察。
- TSB管：培养14天，温度20-25°C。培养前3天观察并记录，后续定期观察。
- 生物制品培养时间至少14天。
(二) 微生物限度检查法 (平皿法)
- 需氧菌总数：
- 取适宜稀释级供试液1ml，置无菌平皿中。
- 注入预先融化并冷却至约45°C的TSA培养基约15-20ml，混匀，凝固。
- 待培养基凝固后，倒置于30-35°C培养3-5天，逐日观察计数菌落。
- 霉菌和酵母菌总数：
- 取适宜稀释级供试液1ml，置无菌平皿中。
- 注入预先融化并冷却至约45°C的SDA培养基约15-20ml，混匀，凝固。
- 待培养基凝固后，正置（或倒置）于20-25°C培养5-7天，逐日观察计数菌落。
- 方法适用性试验： 需证明供试品在该方法下无抑菌性，或抑菌性已被有效消除。需加入5种代表性试验菌（同无菌检查阳性对照菌株）进行回收率试验（回收率应≥70%）。
七、 结果观察与判定
- 无菌检查：
- 阴性对照： 应无菌生长。若有菌生长，试验无效。
- 阳性对照： 应有菌生长。若无菌生长，试验无效。
- 供试品管： 培养期间，若任何一支培养基管出现浑浊（与阴性对照比较）或有微生物生长迹象（肉眼或显微镜观察），即判定供试品 不符合无菌要求。所有培养基管澄清，判供试品 符合无菌要求。
- 微生物限度检查：
- 计数各平皿菌落数，计算每克或每毫升供试品中的菌落数（CFU/g 或 CFU/ml）。
- 结果报告需注明采用的检测方法（平皿法）。
- 判定是否符合产品标准规定的微生物限度标准。
八、 检测结果异常（OOS）处理
- 立即记录并报告异常情况。
- 启动 偏差调查程序，排查可能原因：
- 实验室操作失误（如污染）。
- 培养基/试剂问题。
- 设备故障或环境失控。
- 样品本身问题或取样问题。
- 根据调查结果决定是否进行 复测。复测需谨慎并有充分理由支持，通常需按原样或扩大抽样重新检测。
- 最终判定需基于科学调查和证据。
九、 质量保证与控制
- 人员： 操作人员需经过严格培训考核，具备无菌操作技能和微生物知识。
- 验证： 定期进行培养基无菌性、灵敏度检查；检测方法适用性验证；设备设施（灭菌柜、培养箱、洁净室）验证与校准。
- 环境监控： 严格执行洁净室（区）的日常环境监测计划。
- 记录与报告： 完整、清晰、及时、准确地记录实验过程和结果，出具正式检测报告。
- 菌种管理： 建立规范的试验菌种传代、保存、使用和销毁程序。
- 趋势分析： 定期对环境监控数据、检测结果进行趋势分析，评估系统稳定性。
总结： 灭菌固体产品的微生物检测是确保其安全有效的核心环节。必须严格遵守法规标准，在受控环境下规范操作，并建立完善的质量管理体系进行全过程监控。准确的检测结果对于保障患者安全和产品质量至关重要。
本文内容严格依据现行技术规范编写，适用于灭菌固体产品的微生物质量控制实验室操作参考。