灭菌生物指示剂灭活测试

发布时间：2025-07-24 11:18:19 阅读量：1 作者：生物检测中心

灭菌生物指示剂灭活测试

一、 引言

在医疗、制药和生物技术等领域，灭菌工艺的可靠性和有效性直接关系到产品安全。生物指示剂（Biological Indicator, BI）作为含有特定高抗力微生物的标准化测试系统，是验证和监测灭菌效果的金标准。为确保生物指示剂在灭菌验证或常规监测中能真实反映灭菌过程对目标微生物的杀灭效力，避免因指示剂自身残留活性导致假阳性结果，必须对其进行严格的灭活测试（Fractional Kill or Inactivation Test）。

二、 灭活测试的定义与目的

  • 定义： 灭活测试是指在灭菌工艺开发、验证或周期性再验证中，专门设计用于确认生物指示剂在经历特定的、低于完整灭菌周期的“亚致死”处理后，其上的指示微生物能够被充分灭活至可接受的低水平（通常要求达到≥6 log₁₀的杀灭）的测试。
  • 核心目的：
    1. 验证灭菌工艺的杀灭能力： 证明该工艺参数（如时间、温度、压力、浓度）组合具有强大的杀灭力，能有效挑战生物指示剂的高抗力。
    2. 确认生物指示剂的适用性： 确保所使用的特定批次生物指示剂在设定的“亚致死”条件下能被有效灭活，其性能符合预期。
    3. 防止假阳性结果： 在后续培养中，如果出现阳性结果（指示剂生长），能明确排除是因灭菌前的生物指示剂未被充分灭活所致，从而更准确地指向灭菌工艺本身的问题或操作失误。
    4. 建立工艺安全边际： 证明灭菌工艺参数设定留有足够的安全余量，即使存在轻微波动，也能保证完全灭活。
 

三、 适用范围

灭活测试是以下关键环节的必备组成部分：

  • 灭菌工艺验证（如蒸汽灭菌、干热灭菌、环氧乙烷灭菌、过氧化氢低温等离子体灭菌等）。
  • 灭菌工艺的周期性再验证。
  • 新批次生物指示剂的接收确认。
  • 灭菌设备或工艺发生重大变更后的评估。
 

四、 测试方法概述

灭活测试通常在灭菌柜/腔体内进行，模拟实际灭菌过程，但显著缩短处理时间或降低关键参数（如温度、气体浓度），使其成为一个“亚致死”的暴露过程。具体步骤包括：

  1. 生物指示剂准备：

    • 选择与待验证灭菌工艺相匹配的类型（如湿热灭菌用嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子，环氧乙烷灭菌用萎缩芽孢杆菌孢子）。
    • 确保生物指示剂在有效期内，并记录批号。
    • 通常需要测试一定数量（如10-20个）的生物指示剂样本。

  2. “亚致死”条件设定：

    • 这是测试设计的核心。条件必须足够“温和”，使得指示剂上的微生物不被完全杀灭，但又足够“强烈”，能够证明工艺的杀灭力（通常目标是在后续培养中实现≥6 log₁₀的杀灭）。
    • 设定依据通常基于：
      • 生物指示剂的已知D值（在特定条件下杀灭90%微生物所需的时间或剂量）。
      • 目标灭菌水平（如SAL 10⁻⁶）。
      • 经验数据或文献参考。
    • 示例： 对于121°C饱和蒸汽灭菌工艺，完整的灭菌时间可能是15分钟（达到SAL 10⁻⁶）。灭活测试可能设定为121°C下暴露2-4分钟（具体时间需计算，通常目标是达到约6 log杀灭）。

  3. 测试执行：

    • 将准备好的生物指示剂样本按照常规灭菌装载方式放置于灭菌设备内最难灭菌的位置（如冷点）。
    • 运行灭菌程序，但仅执行设定的“亚致死”暴露时间或参数。
    • 同时设置：
      • 阴性对照： 未经任何处理的同批次生物指示剂（应100%生长阳性）。
      • 阳性对照： 经过完整灭菌周期的同批次生物指示剂（应100%生长阴性）。

  4. 处理后处理：

    • 严格按照生物指示剂制造商提供的说明进行操作。例如：
      • 对于自含式生物指示剂（SCBI），可能需要在处理后压碎安瓿瓶使培养液接触载体。
      • 对于芽孢条，需在无菌条件下将载体转移至无菌培养液中。
    • 所有操作需在适当生物安全条件下进行（如二级生物安全柜），避免污染。

  5. 培养与观察：

    • 将处理后的生物指示剂样本、阴性对照和阳性对照置于推荐的温度下培养（如56-60°C培养嗜热脂肪地芽孢杆菌）。
    • 按制造商规定的时间（通常24-48小时，有时需7天）观察颜色变化（如由紫变黄）或荧光信号。
    • 记录每个样本的生长/不生长结果。

  6. 结果计算与判定：

    • 统计灭活测试组中未生长（即被灭活）的生物指示剂数量。
    • 计算灭活率（Log Reduction）：
      灭活率 (Log₁₀) = Log₁₀(灭活测试组初始活孢子总数) - Log₁₀(灭活测试组培养后长出的阳性样本数)
      • 初始活孢子总数：通常由制造商提供该批次BI的标称孢子量（如1 x 10⁶ CFU/载体）。
      • 培养后长出的阳性样本数：即培养后显示生长的BI数量。
    • 合格标准（普遍接受）：
      • 灭活测试组：必须达到≥6.0 log₁₀的杀灭（即培养后长出的阳性样本数 ≤ 初始标称孢子量的百万分之一）。例如，标称孢子量为1 x 10⁶/载体，测试20个BI，则培养后阳性数应≤ 1（理论上，10⁶ / 10⁶ = 1）。
      • 阴性对照组：必须100%生长阳性，证明测试系统有效，指示剂本身具有活性。
      • 阳性对照组：必须100%生长阴性，证明完整的灭菌周期是有效的。
    • 若灭活测试结果达标（≥6 log杀灭）且阴阳性对照结果符合要求，则本次灭活测试通过。否则，需调查原因（如参数设定不合理、BI批次问题、设备问题、操作失误等），重新进行测试。
 

五、 关键注意事项

  1. 严格遵守法规与标准： 测试设计、执行和结果判定需严格遵循相关的国家/国际法规（如GMP）和标准（如ISO 11138系列《保健产品灭菌 生物指示剂》、ISO 18472《灭菌用生物指示剂的选用、使用及结果判断指南》、ISO 17665/11135等灭菌过程标准）。
  2. 科学设计“亚致死”条件： 参数设定是测试成功的关键，应基于生物指示剂的D值和目标杀灭水平进行科学计算和验证。条件过于严苛可能导致完全杀灭（测试无效），过于温和则无法证明工艺能力。
  3. 代表性位置： 生物指示剂必须放置在灭菌设备内公认的最难灭菌的位置（冷点），确保测试代表最坏情况。
  4. 生物安全： 处理未经完全灭活的生物指示剂（尤其在转移芽孢条时）存在生物安全风险，务必在适当防护条件下操作。
  5. 记录完整： 详细记录测试日期、所用设备、程序参数、生物指示剂信息（名称、批号、标称孢子量）、样本数量、放置位置、培养条件、观察结果、计算结果及判定结论等。
  6. 区分于存活曲线和D值测定： 灭活测试是工艺验证的一部分，目标是确认在特定亚致死条件下能达到高水平的杀灭（≥6 log），而非精确测定D值（后者需要多个不同暴露时间点的存活数据）。
 

六、 结论

灭菌生物指示剂的灭活测试是保障灭菌工艺验证科学性和结果可靠性的基石。它通过模拟“亚致死”条件，有力证明了灭菌工艺具备强大的杀灭能力，所使用的生物指示剂性能符合要求，并能有效防止假阳性结果的干扰。严格遵循标准化的测试方法和合格标准，是确保医疗器械、药品和生物制品达到无菌保证水平（SAL ≤ 10⁻⁶）的关键环节。执行灭活测试，是对灭菌工艺有效性和产品使用者安全的重要承诺。

免责声明： 本文旨在提供关于灭菌生物指示剂灭活测试的通用性技术信息概述。具体操作必须严格依据现行有效的国家/国际法规、标准、设备制造商说明书和生物指示剂制造商说明书执行。