灭菌生物指示剂存活测试

灭菌生物指示剂存活测试：原理、流程与意义

灭菌生物指示剂（Biological Indicator, BI）是验证灭菌过程有效性的核心工具。存活测试（Survival Test）作为其关键质量控制环节，确保了指示剂在灭菌前含有足够且稳定的活性微生物，是灭菌成败判定的前提基础。

一、 生物指示剂与存活测试概述

• 生物指示剂本质： 一种标准化制备的、含有已知高抗力微生物（最常见为嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子，用于蒸汽和过氧化氢等离子体灭菌；萎缩芽孢杆菌孢子用于环氧乙烷灭菌）的产品。其孢子负载量（通常为10^5 到 10^6 CFU）和抗力均经过严格标定。
• 存活测试目的： 在生物指示剂使用（经历灭菌过程）之前，确认该批次产品本身所含的微生物是存活且具有繁殖能力的。这是确保后续灭菌挑战试验（杀灭测试 Kill Test）结果有效性的必备条件。若存活测试失败（微生物不生长），则无论后续灭菌是否成功，该次验证结果均无效。

二、 存活测试的核心原理

存活测试的核心原理极其直接：将未经过灭菌处理的生物指示剂，在适宜的培养基和培养条件下进行培养，观察微生物是否能够生长并产生可见的变化（如培养基变色、浑浊）。成功生长即证明微生物存活。

三、 标准化操作流程

为确保结果可靠，存活测试必须严格按照既定程序和标准操作规范（SOP）执行：

1. 测试环境准备： 在洁净度符合要求的环境（如生物安全柜或洁净工作台）中进行操作，防止污染。操作人员需穿戴合适的个人防护装备（PPE）。
2. 样品与对照选取：
   • 测试样品： 从待测批次生物指示剂中，按相关标准（如ISO 11138系列）或内部质量控制计划要求，随机抽取规定数量的未灭菌指示剂单元。
   • 阳性对照： 必须包含已知存活的、与测试样品相同种类的生物指示剂。阳性对照成功生长是本次测试有效的前提。
   • 阴性对照： 必须包含仅含无菌培养基的培养管（或安瓿瓶）。阴性对照应保持无菌状态无生长，以排除培养基污染。
3. 激活与培养：
   • 根据生物指示剂类型，可能需要激活（如压碎内含孢子条或培养基安瓿瓶）。严格遵循制造商提供的说明（避免引入企业名，此处指操作说明本身）。
   • 将激活后的测试样品、阳性对照、阴性对照，放入指定的生长培养基中（通常是胰酪大豆胨液体培养基TSB或等效培养基）。
   • 将培养管/瓶置于微生物最适生长温度下培养（嗜热脂肪地芽孢杆菌通常在55-60℃；萎缩芽孢杆菌通常在30-35℃）。
   • 培养时间至少为制造商规定的最大培养时间（通常为24小时以上，如24-48或最多7天），确保慢生长的孢子有足够时间萌发增殖。
4. 结果观察与判读：
   • 定期观察（如每天）： 观察培养基状态变化。
     • 生长（存活）标志： 培养基出现明显的浑浊、沉淀或颜色变化（若使用含酸碱指示剂的培养基，如变黄）。
     • 无生长（失活）标志： 培养基保持清澈透明，颜色无变化。
   • 最终判读（培养结束时）：
     • 测试样品： 所有被测试的未灭菌生物指示剂必须显示出生长的迹象（浑浊/变色）。此为存活测试通过。
     • 阳性对照： 必须显示生长。否则，本次测试无效，需调查原因（如培养基失效、培养条件错误）后重试。
     • 阴性对照： 必须显示无生长。若有生长，说明测试过程中存在污染，本次测试无效，需调查后重试。
5. 记录与报告： 详细记录测试日期、操作人员、生物指示剂批号、培养温度、培养时间、每次观察结果（清晰描述每个样品、对照的生长状况）、最终结论（存活测试通过/失败）、以及任何偏差或异常情况。

四、 存活测试的关键意义与应用

1. 保障灭菌验证的有效性： 存活测试是灭菌验证（如装载挑战测试、灭菌过程确认PQ）不可或缺的前置步骤。只有确认使用的BI在灭菌前是活体，后续杀灭后阴性（无菌生长）的结果才能可靠证明灭菌过程成功杀灭了高抗力的微生物。
2. BI产品放行的核心质量指标： 是生物指示剂制造商出厂放行和用户接收时的重要质量控制项目，确保每批BI在有效期内具备应有的生物活性。
3. 支持故障调查： 如果灭菌后的杀灭测试出现阳性（有生长），存活测试结果（证明灭菌前该BI是活的）是排除BI本身质量问题（如出厂时已失活）的关键证据，有助于将调查重点集中在灭菌过程本身。

五、 关键质量控制点与注意事项

• 严格无菌操作： 防止外源性污染导致假阳性结果。
• 精确的温度控制： 培养温度必须控制在目标微生物的最适生长范围，过高或过低都可能抑制生长导致假阴性。
• 足够的培养时间： 必须培养至制造商规定的最长时间，确保复苏缓慢的孢子有充分机会萌发生长。
• 对照的完整性： 阳性对照和阴性对照必须同时设立且结果符合预期，测试结果才有效。
• 标准化培养基： 使用验证合格的、适合目标微生物生长的培养基。
• 人员培训： 操作人员需经过充分培训，理解原理并熟练掌握操作细节和结果判读标准。
• 记录完整性： 详尽、准确的记录是追溯和质量溯源的基础。

总结：

灭菌生物指示剂存活测试是一个看似简单但至关重要的质量控制环节。它通过直接培养未灭菌的指示剂，验证其内包含的微生物在经历灭菌挑战前是存活且可培养的。严格遵守标准化的操作流程、确保对照有效、精确控制培养条件并准确判读结果，是保证该测试有效可靠的关键。存活测试的成功通过，为后续利用生物指示剂进行灭菌效果判定提供了坚实的基础，是确保医疗器械、药品和无菌产品安全性的重要保障。