湿热灭菌效果测试：原理、方法与实践

一、引言

湿热灭菌是利用高温高压水蒸气的热穿透性和潜热效应，使微生物细胞内蛋白质变性、核酸降解、细胞膜破坏，从而达到灭菌目的的经典方法。其具有灭菌效率高、适用性广、无残留等特点，广泛应用于**制药（如注射剂、输液瓶）、医疗（如手术器械、敷料）、食品（如罐头、无菌饮料）**等领域，是保障产品安全与质量的核心环节。

然而，湿热灭菌的效果受温度分布、压力控制、时间参数、负载特性等多种因素影响。若灭菌不彻底，可能导致微生物残留，引发产品变质、患者感染等严重后果。因此，灭菌效果测试是验证灭菌工艺有效性、确保符合法规要求（如GMP、FDA、ISO 11138）的关键步骤。

二、湿热灭菌效果测试的核心逻辑

湿热灭菌的有效性取决于**“灭菌三要素”**：

1. 温度：通常为121℃（15psi，121℃/15min）或134℃（30psi，134℃/3min），需确保灭菌柜内所有区域达到目标温度；
2. 时间：在目标温度下的持续时间，需满足微生物死亡的对数递减（如10⁶级芽孢杀灭，即“无菌保证水平SAL≤10⁻⁶”）；
3. 湿度：饱和水蒸气的潜热（约2260kJ/kg）是热穿透的关键，干燥热空气的灭菌效率远低于湿热。

测试的核心目标是验证灭菌工艺能否稳定、一致地达到上述三要素，并通过物理、生物、化学方法综合评估灭菌效果。

三、湿热灭菌效果测试的主要内容

（一）物理测试：验证工艺参数的一致性

物理测试是通过传感器实时监测灭菌柜内的温度、压力、时间，确保这些参数符合预设的灭菌程序（如121℃×15min），且在负载的所有关键位置（如冷点）均达标。

1. 温度分布验证（Temperature Distribution Mapping）

• 目的：确定灭菌柜内的温度均匀性，找到“冷点”（即温度最低、最不易达到目标温度的区域）。
• 方法：
  • 使用热电偶温度传感器（精度±0.5℃）或无线温度记录仪，在灭菌柜内布点（通常10-20个点，包括角落、顶部、底部、负载中心等）；
  • 进行空载（无负载）、半载、满载三种状态的测试（满载需模拟实际生产中的负载类型，如输液瓶、器械包）；
  • 记录灭菌过程中各点的温度曲线，分析是否所有点均达到目标温度（如121℃）且持续时间符合要求。
• 判定标准：所有测试点的温度偏差需≤±1℃，冷点温度需≥目标温度，且持续时间≥预设时间。

2. 压力与时间监测

• 压力：通过灭菌柜自带的压力传感器监测，确保灭菌阶段的压力与温度匹配（如121℃对应15psi，134℃对应30psi）；
• 时间：记录从达到目标温度到开始降温的时间，确保满足“保温时间”要求（如15min）。

（二）生物测试：验证微生物杀灭效果

生物测试是直接评估灭菌效果的“金标准”，通过挑战高抗性微生物（如嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus 孢子），验证灭菌工艺能否将其杀灭至SAL≤10⁻⁶。

1. 生物指示剂（BI）的选择

• 标准生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（ATCC 7953或CMCC 63501），其D值（在121℃下杀灭90%孢子所需时间）约为1.5-3.0min，适用于121℃×15min的灭菌工艺；
• 规格：每片/每支BI的孢子含量需为10⁶-10⁷CFU（ colony-forming unit，菌落形成单位），符合ISO 11138标准。

2. 测试方法

• 布点：将BI放置在灭菌柜的冷点（通过温度分布验证确定）、负载中心、难以穿透的位置（如器械包内部）；
• 灭菌处理：按照预设的灭菌程序运行（如121℃×15min）；
• 培养与结果判断：
  • 灭菌后的BI需在55-60℃下培养48-72小时（嗜热脂肪芽孢杆菌的最适生长温度）；
  • 若所有BI均无生长（澄清或不变色，取决于BI类型），则判定灭菌合格；若有任一BI生长，需调查原因（如工艺参数偏差、BI污染）并重新测试。

3. 阳性对照与阴性对照

• 阳性对照：未灭菌的BI培养，需有明显生长（证明BI活性）；
• 阴性对照：无菌培养基培养，需无生长（证明培养过程无污染）。

（三）化学测试：快速指示工艺参数达标

化学测试通过**化学指示剂（CI）**的颜色变化，快速判断灭菌过程是否达到目标温度和时间，是物理测试的补充。

1. 化学指示剂的类型

• 类别1：过程指示剂（如灭菌指示胶带），仅指示是否经过灭菌处理（颜色变化），不反映参数是否达标；
• 类别5：积分指示剂（如121℃化学指示卡），需同时满足温度和时间要求才会变色（如从红色变为蓝色），更接近生物指示剂的特性。

2. 测试方法

• 将化学指示剂与BI一同放置在灭菌柜的关键位置；
• 灭菌后观察颜色变化：若符合 manufacturer 规定的终点颜色（如121℃指示卡变蓝），则说明工艺参数达标；若未变色，需结合物理测试和生物测试结果分析原因。

四、湿热灭菌效果测试的流程与周期

（一）测试流程

1. 预实验：调试灭菌柜，确保设备运行正常（如门密封良好、蒸汽供应稳定）；
2. 温度分布验证：确定冷点，优化负载摆放方式；
3. 生物测试与化学测试：在空载、半载、满载状态下，同步进行BI和CI测试；
4. 数据记录与分析：记录温度曲线、压力数据、BI培养结果、CI颜色变化，生成验证报告；
5. 偏差处理：若测试失败（如冷点温度不足、BI生长），需调查原因（如负载摆放过密、蒸汽质量差），采取纠正措施（如调整负载、维修设备）后重新测试。

（二）测试周期

• 初次验证：新设备安装后、新工艺实施前，需进行完整的验证（温度分布+生物+化学测试）；
• 日常监测：每批生产前，需使用化学指示剂快速检查（如灭菌指示卡）；每月/季度进行生物指示剂测试（如每批生产抽测1-2个BI）；
• 再验证：当设备发生重大变更（如维修、更换部件）、负载类型改变（如新增产品）、法规要求更新时，需重新进行全面验证；
• 定期回顾：每年对灭菌效果数据进行回顾，确保工艺稳定性（如趋势分析温度偏差、BI不合格率）。

五、常见问题与解决策略

（一）冷点温度不达标

• 原因：负载摆放过密（阻碍蒸汽穿透）、灭菌柜风道堵塞、蒸汽压力不足；
• 解决：优化负载摆放（如留间隙）、清理风道、检查蒸汽供应系统（如锅炉压力）。

（二）生物指示剂生长

• 原因：灭菌时间不足、温度偏差、BI本身污染（如过期）；
• 解决：核对工艺参数（如保温时间）、校准温度传感器、检查BI有效期（需冷藏保存，通常2-8℃）。

（三）化学指示剂变色不一致

• 原因：指示剂过期、放置位置不当（如靠近蒸汽入口，温度过高）；
• 解决：更换有效期内的指示剂、按照 manufacturer 要求布点（如远离蒸汽入口）。

六、结论

湿热灭菌效果测试是保障产品无菌性的“最后一道防线”，其核心是通过物理参数验证（确保工艺一致）、生物挑战（直接评估杀灭效果）、化学指示（快速监控）的综合手段，确保灭菌工艺稳定、有效。

在实践中，企业需严格遵循法规要求（如GMP第11章“灭菌工艺验证”），建立完善的测试程序，定期进行验证与回顾，并针对偏差及时采取纠正措施。只有这样，才能真正实现“无菌保证”，保障消费者与患者的安全。

参考文献（示例）：

1. ISO 11138-1:2017 《Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 1: General requirements》；
2. USP <1229> 《Sterilization Process Validation in Aseptic Processing》；
3. GMP 2010版 《药品生产质量管理规范》第11章“灭菌工艺”；
4. FDA Guidance for Industry 《Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing》。