LC-MS高分辨质谱分子量检测 - 中析研究所生物检测中心

LC-MS高分辨质谱分子量检测：精准解析物质世界的基石

高分辨液相色谱-质谱联用技术是现代分析科学的核心工具，其中基于质谱的高精度分子量测定能力是其核心价值所在。以下是对该技术原理、流程和应用的全面解析：

高效分离 (LC部分)：
- 复杂样品首先通过液相色谱柱进行物理分离。
- 利用样品中各组分在流动相（液体）和固定相（色谱柱填料）间分配系数的差异实现分离。
- 目标化合物在不同时间点（保留时间）依次流出色谱柱，进入质谱系统。
精准测量 (HRMS部分)：
- 离子化： 流出组分在离子源（如ESI、APCI）中被转化为气相带电离子（[M+H]⁺、[M-H]⁻等）。
- 质量分析： 关键步骤发生在高质量分辨率的质量分析器中：
  - 轨道阱（Orbitrap）： 离子在静电场中做谐震荡，频率与质荷比（m/z）平方根成反比，测量频率计算m/z。分辨率可达10万至100万以上（FWHM定义）。
  - 飞行时间（TOF）： 离子在无场区飞行，速度与质荷比平方根成反比，测量飞行时间计算m/z。分辨率通常在2万至8万之间。
  - 傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）： 超高磁场中离子回旋，测量回旋频率计算m/z，分辨率可达百万级以上（目前分辨率最高）。
- 检测器： 测量离子信号强度，生成质谱图（离子强度 vs. m/z）。

分辨率（Resolving Power）：
- 定义：区分相邻质量峰的能力（通常指Δm为峰宽时对应的m值）。
- 表示：R = m / Δm（如 m/z 400处 Δm = 0.01 Da，则 R=40,000）。
- 核心价值： 高分辨率可清晰分开质量差极小的离子（如同位素峰、同量异位素离子），提供更“干净”、信息更准确的质谱图。
质量精度（Mass Accuracy）：
- 定义：实测分子量与理论分子量之间的偏差。
- 表示：通常以百万分率（ppm）或毫道尔顿（mDa）表示（如实测值200.0012 Da，理论值200.0000 Da，偏差1.2 mDa 或 6 ppm）。
- 核心价值： 高精度（通常<5 ppm，甚至<1 ppm）是准确定性和分子式推断的基础。分辨率是获得高精度的前提。
灵敏度：
- 在特定分辨率要求下检测低丰度物质的能力，受离子化效率、传输效率和检测器性能影响。
动态范围：
- 同时检测样品中高丰度和极低丰度组分的能力。

精确分子量获取：
- 实验获得目标离子峰（如[M+H]⁺）的精确m/z值。
- 扣除加成物质量（如H⁺ = 1.007825 Da）计算中性分子的精确质量（[M]）。
- 通常报告单同位素质量（丰度最高的轻同位素组成的分子质量）。
分子式推导（关键应用）：
- 利用高精度分子量（如<5 ppm误差）结合同位素分布拟合进行。
- 软件根据元素组成（C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br, I等）限制生成候选分子式。
- 计算每个候选分子式的理论精确质量和理论同位素分布。
- 与实测值比对：
  - 质量误差：是否在设定容许范围（如<3-5 ppm）。
  - 同位素丰度拟合度： 实测同位素峰簇（如M, M+1, M+2峰）的相对强度分布是否与理论分布高度匹配（常用mSigma值评估）。这是高分辨质谱区分同量异位素的关键优势。
- 综合评估后确定最可能分子式。
数据还原度：
- 指实测谱图（峰形、同位素分布）与理论谱图的吻合程度。
- 高质量（高分辨、高精度、低噪音）数据还原度好，分子式推断更可靠。

核心优势：
- 高特异性： 强大的质量分辨能力区分复杂基质中的化合物。
- 高准确性： 提供精确分子质量，是定性分析的基石。
- 高信息量： 同时提供分子量和丰富的同位素信息。
- 通用性好： 广泛适用于各类有机/生物分子。
当前挑战：
- 成本： 高分辨率仪器购置和维护成本较高。
- 异构体区分： 仅凭精确分子量通常无法区分同分异构体（结构不同但分子量相同），需结合色谱保留时间、串联质谱或离子淌度等技术。
- 基质效应： 复杂样品基质可能抑制或增强目标物离子化效率，影响准确度和灵敏度。
- 数据分析复杂性： 海量数据需要专业的处理软件和经验丰富的分析人员。