止血敷料凝血时间检测的原理、方法与应用

引言

止血敷料是创伤急救与外科手术中不可或缺的医疗用品，其通过物理阻塞、化学促凝或生物活性作用加速血液凝固，减少出血。凝血时间检测是评估止血敷料性能的核心指标之一，直接反映敷料对凝血过程的干预效果。准确、标准化的凝血时间检测不仅是止血敷料研发、生产质控的关键环节，也是临床选择与应用敷料的重要依据。本文将系统阐述止血敷料凝血时间检测的原理、常用方法、操作要点及影响因素，为相关研究与实践提供参考。

一、凝血时间检测的基本原理

凝血过程是一个复杂的级联反应，涉及内源性（接触激活）、外源性（组织因子）及共同途径（凝血酶生成与纤维蛋白形成）。止血敷料的作用机制可分为三类：

1. 物理止血：通过多孔结构吸附血液成分（如红细胞、血小板），形成机械阻塞；
2. 化学促凝：释放钙离子、磷离子等电解质，促进凝血因子活化；
3. 生物活性：含有凝血酶、纤维蛋白原、壳聚糖、胶原蛋白等成分，直接参与或激活凝血途径。

凝血时间检测的本质是通过监测血液从液态转为固态的时间，评估敷料对上述途径的影响。常用检测指标包括凝血启动时间（如活化部分凝血活酶时间，APTT）、凝血酶生成时间（如凝血酶原时间，PT）、血栓形成速度与强度（如血栓弹力图，TEG）等。

二、常用凝血时间检测方法

（一）全血凝固时间（Whole Blood Clotting Time, WBCT）

原理：直接观察全血与敷料接触后自然凝固的时间，反映内源性与外源性途径的综合作用，是最直观的筛选方法。
操作步骤：

1. 采集健康人静脉血（避免肝素抗凝），立即置于37℃水浴预热；
2. 取2 mL全血加入含敷料样本（或浸提液）的试管中，轻轻混匀；
3. 开始计时，每隔30秒倾斜试管（45°），直至血液不再流动，记录时间。
   特点：操作简单、成本低，但受血小板数量、血管内皮状态影响大，重复性较差，适用于初步筛选。

（二）活化部分凝血活酶时间（Activated Partial Thromboplastin Time, APTT）

原理：加入磷脂（模拟血小板膜）与活化剂（如白陶土、鞣花酸）激活内源性凝血途径，再加入钙离子启动凝血，检测血浆凝固时间。主要反映Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ等内源性凝血因子的活性及敷料对该途径的影响。
操作步骤：

1. 采集静脉血，用枸橼酸钠抗凝（1:9），离心分离血浆；
2. 取50 μL血浆与50 μL APTT试剂（含磷脂与活化剂）混匀，37℃孵育3分钟；
3. 加入50 μL 0.025 mol/L氯化钙溶液，启动凝血，仪器自动记录凝固时间。
   特点：敏感度高，是内源性途径的经典指标，适用于评估含肝素、水蛭素等抗凝成分敷料的中和效果，或含胶原蛋白、壳聚糖等促凝成分敷料的作用。

（三）凝血酶原时间（Prothrombin Time, PT）

原理：加入组织因子（TF）与钙离子激活外源性凝血途径，检测血浆凝固时间。主要反映Ⅶ因子活性及敷料对外源性途径的影响（如含组织因子的生物敷料）。
操作步骤：

1. 分离血浆（同APTT）；
2. 取100 μL血浆与100 μL PT试剂（含组织因子、磷脂）混匀，37℃孵育；
3. 仪器自动记录凝固时间，结果以国际标准化比值（INR）表示（消除试剂差异）。
   特点：特异性强，适用于评估外源性途径促凝敷料（如纤维蛋白胶）的效果，或监测含维生素K拮抗剂敷料的影响。

（四）血栓弹力图（Thrombelastography, TEG）

原理：通过检测全血凝固过程中切应力的变化，动态监测凝血启动（R值）、血栓形成速度（K值、α角）、血栓强度（MA值）及纤溶活性（LY30），全面反映凝血与纤溶的平衡。
操作步骤：

1. 采集全血（可加少量抗凝剂，检测时复钙）；
2. 取340 μL全血加入TEG杯，37℃预热；
3. 加入10 μL氯化钙溶液启动凝血，仪器记录凝血全过程曲线。
   特点：动态、全面，可区分敷料对凝血不同阶段的影响（如R值缩短提示凝血启动快，MA值增加提示血栓强度高），是个性化评估止血效果的重要工具，尤其适用于复杂创伤或凝血功能异常患者的敷料选择。

（五）血小板功能分析仪（Platelet Function Analyzer, PFA-100/200）

原理：模拟血管损伤环境（如胶原+ADP或胶原+肾上腺素涂层），检测全血通过微通道的闭塞时间（CT），反映血小板黏附、聚集功能及敷料对血小板的激活作用。
操作步骤：

1. 采集全血（枸橼酸钠抗凝）；
2. 将血样注入检测卡，通过微通道时血小板黏附、聚集形成血栓，阻塞通道；
3. 记录闭塞时间（CT），正常参考值为80-120秒（胶原+ADP）。
   特点：快速（5-10分钟）、微量（1.8 mL血），适用于评估含血小板激活成分敷料（如胶原蛋白）的效果，或监测抗血小板药物与敷料的相互作用。

三、操作要点与标准化

（一）样本制备

1. 血液采集：使用硅化试管避免凝血因子激活，采血后30分钟内完成检测（全血）或分离血浆（2小时内检测）；
2. 敷料处理：采用浸提液（如生理盐水、磷酸盐缓冲液）模拟临床应用中的溶出情况，浸提条件（比例1:10，37℃，24小时）需符合ISO 10993-12标准；
3. 对照设置：设立空白对照（无敷料）、阳性对照（已知有效止血敷料）、阴性对照（无促凝作用材料），确保结果可比性。

（二）仪器与试剂

1. 仪器校准：定期用标准血浆校准凝血分析仪（如APTT、PT），TEG需用质控品验证曲线参数；
2. 试剂选择：使用与检测方法匹配的试剂（如APTT试剂需含足够磷脂），避免过期试剂影响结果。

（三）环境控制

1. 温度：凝血反应的最适温度为37℃，检测过程中需保持恒温（±0.5℃）；
2. 湿度：避免样本蒸发，尤其是全血检测（如WBCT）需加盖试管。

四、影响检测结果的因素

（一）敷料本身特性

1. 成分：含凝血酶、纤维蛋白原的敷料可显著缩短PT、APTT；含壳聚糖的敷料通过激活血小板与内源性途径缩短WBCT；
2. 剂型：粉末状敷料比片状敷料更易分散，与血液接触面积大，凝血时间更短；
3. 溶出速率：缓释型敷料的促凝成分缓慢释放，凝血时间可能延长。

（二）样本因素

1. 凝血因子水平：患者（或健康志愿者）的Ⅷ、Ⅸ因子缺乏（如血友病）会延长APTT，影响敷料效果评估；
2. 血小板计数：血小板减少（如血小板<50×10⁹/L）会延长WBCT、PFA-100 CT；
3. 药物影响：阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物会抑制血小板功能，延长PFA-100 CT；肝素会延长APTT。

（三）操作因素

1. 计时准确性：WBCT需人工计时，误差较大；仪器检测（如APTT、TEG）可提高准确性；
2. 混匀程度：全血与敷料混匀不充分会导致凝血时间延长；
3. 样本量：微量样本（如PFA-100仅需1.8 mL血）需严格控制体积，避免误差。

五、结果解读与应用

（一）结果解读

1. 缩短凝血时间：提示敷料具有促凝作用，如APTT缩短（内源性途径激活）、PT缩短（外源性途径激活）、TEG R值缩短（凝血启动快）；
2. 无显著变化：敷料无明显促凝或抗凝作用，可能仅通过物理阻塞止血；
3. 延长凝血时间：提示敷料含抗凝成分（如肝素），需警惕临床应用中的出血风险。

（二）临床与科研应用

1. 研发阶段：通过检测不同配方敷料的凝血时间，优化成分比例（如壳聚糖与纤维蛋白原的组合）；
2. 生产质控：批量检测确保敷料凝血性能一致性，符合医疗器械标准（如ISO 13485）；
3. 临床决策：根据患者凝血功能（如TEG结果）选择合适敷料（如凝血启动慢的患者选用含凝血酶的敷料）；
4. ** regulatory 申报**：提供凝血时间数据支持敷料的有效性（如FDA、CE认证要求）。

六、展望

随着止血敷料技术的发展（如生物可吸收敷料、智能响应敷料），凝血时间检测也在向快速化、微型化、智能化方向发展。例如，微流控芯片可模拟体内血管环境，实时监测敷料与血液的相互作用；生物传感器可通过电化学信号快速检测凝血酶生成；人工智能可分析TEG曲线，自动识别敷料的作用阶段。这些新技术将进一步提高检测的准确性与效率，为止血敷料的研发与应用提供更强大的支持。

结论

凝血时间检测是评估止血敷料性能的关键手段，不同方法各有优缺点（见表1）。在实际应用中，需根据敷料的作用机制、检测目的及样本特点选择合适的方法，并严格遵循标准化操作，减少误差。未来，随着检测技术的进步，凝血时间检测将更精准地反映敷料的止血效果，为临床提供更安全、有效的止血解决方案。

表1 常用凝血时间检测方法比较