甘草中甘草酸的比色法检测及其应用

引言

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）为豆科甘草属多年生草本植物，是我国传统中药材之一，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳等功效。甘草的主要活性成分是甘草酸（glycyrrhizic acid），又称甘草甜素，属于三萜皂苷类化合物，其含量是评价甘草质量的重要指标。《中国药典》（2020版）规定，甘草药材中甘草酸（以甘草酸单铵盐计）的含量不得低于2.0%。

目前，甘草酸的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）和比色法等。其中，HPLC因分离效果好、准确性高，是目前的主流方法，但仪器成本高、操作复杂，难以满足基层实验室或批量样品的快速检测需求。比色法作为一种经典的分析方法，具有操作简便、设备要求低、成本低廉等优势，适合现场检测或大规模样品筛查。本文基于香草醛-浓硫酸显色体系，建立了甘草中甘草酸的比色检测方法，并对其可行性进行了验证。

1 实验原理

甘草酸属于三萜皂苷，其分子结构中含有多个羟基和羧基。在浓硫酸作用下，甘草酸发生脱水反应，生成具有共轭双键的烯酮类化合物；随后，烯酮类化合物与香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛）发生缩合反应，形成稳定的红色至紫红色络合物。该络合物在550 nm左右的可见光区有最大吸收，吸光度与甘草酸浓度在一定范围内呈线性关系，可通过比色法测定其含量。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 样品

甘草药材：购于某中药材市场，经鉴定为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根及根茎，粉碎后过40目筛，备用。

2.1.2 试剂

甘草酸标准品（纯度≥98%，中国药品生物制品检定所）；香草醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；浓硫酸（98%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（70%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；石油醚（60~90℃，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2.1.3 仪器

722型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；电子天平（FA2004，上海天平仪器厂）；恒温水浴锅（HH-S2，金坛市医疗仪器厂）；离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂）；旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）。

2.2 实验方法

2.2.1 样品处理

（1）脱脂：取甘草粉末2.0 g，加入石油醚50 mL，回流提取2次（每次1 h），过滤，弃去石油醚层，残渣挥干溶剂，备用。
（2）提取：将脱脂后的残渣加入70%乙醇50 mL，80℃回流提取2次（每次2 h），合并提取液，过滤，滤液减压浓缩至约10 mL，转移至25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，作为样品溶液。
（3）澄清：取样品溶液5 mL，加入2 mL蒸馏水，混匀后离心（3000 r/min，10 min），取上清液备用。

2.2.2 标准曲线的制备

精密称取甘草酸标准品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，得到0.1 mg/mL的标准储备液。分别吸取标准储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞试管中，用70%乙醇补足至1.0 mL，加入5%香草醛乙醇溶液0.5 mL，摇匀，置于60℃水浴中加热10 min，取出后立即加入浓硫酸4.0 mL，继续加热15 min，冷却至室温。以70%乙醇为空白对照，在550 nm波长下测定吸光度（A）。以甘草酸浓度（C，mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.3 样品测定

吸取澄清后的样品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按照2.2.2的方法进行显色反应，测定吸光度。根据标准曲线计算样品中甘草酸的浓度，再换算成样品中的含量（%）。

2.2.4 方法学验证

（1）线性范围：考察甘草酸浓度在0.02~0.1 mg/mL范围内的线性关系。
（2）精密度：取同一批样品溶液，重复测定5次，计算相对标准偏差（RSD）。
（3）回收率：取已知含量的甘草样品（编号S1），加入一定量的甘草酸标准品（相当于样品中甘草酸含量的80%、100%、120%），按照2.2.1的方法处理后测定，计算回收率。
（4）稳定性：取同一显色后的溶液，分别在0、15、30、45、60 min时测定吸光度，观察其变化。

3 结果与分析

3.1 标准曲线

甘草酸标准溶液的吸光度与浓度的关系如图1所示。结果表明，甘草酸浓度在0.02~0.1 mg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：
$A=8.25C+0.012$
相关系数$R^2=0.9987$，说明该方法的线性范围符合检测要求。

3.2 精密度实验

同一批样品溶液重复测定5次的吸光度分别为0.321、0.318、0.323、0.320、0.319，平均值为0.320，RSD为0.62%（<5%），表明方法的精密度良好。

3.3 回收率实验

回收率实验结果如表1所示。加标回收率在96.2%~102.5%之间，平均回收率为99.1%，RSD为2.1%（<5%），说明方法的准确性较高。

3.4 稳定性实验

显色后的溶液在0~60 min内的吸光度变化如图2所示。结果表明，吸光度在60 min内基本稳定（RSD=0.85%），说明显色产物在该时间范围内具有良好的稳定性，可满足检测需求。

3.5 样品测定

对3批甘草样品（编号S1、S2、S3）进行测定，结果如表2所示。3批样品的甘草酸含量分别为2.31%、2.15%、2.08%，均符合《中国药典》（2020版）的规定（≥2.0%）。

4 讨论

4.1 显色条件的优化

（1）香草醛浓度：实验考察了2%、5%、10%的香草醛乙醇溶液对显色的影响。结果表明，5%的香草醛溶液显色效果最佳，吸光度最高且稳定；2%的溶液显色不足，吸光度低；10%的溶液则因浓度过高，导致背景吸收增加。
（2）浓硫酸用量：浓硫酸的用量直接影响脱水反应的进行。实验发现，当浓硫酸用量为4.0 mL时，显色产物的吸光度最大且稳定；若用量不足（<3.0 mL），脱水不完全，吸光度低；若用量过多（>5.0 mL），则会导致过度碳化，吸光度下降。
（3）反应温度与时间：实验考察了50℃、60℃、70℃下的反应时间（10、15、20 min）。结果表明，60℃加热15 min时，显色产物的吸光度最高且稳定；温度过高（70℃）或时间过长（>20 min）会导致络合物分解，吸光度下降。

4.2 干扰因素的排除

甘草中含有黄酮类、多糖类、脂溶性杂质等成分，可能干扰显色反应。实验中采用石油醚脱脂，可有效去除脂溶性杂质（如甾醇、油脂等）；用70%乙醇提取甘草酸，可避免多糖类成分的溶出（多糖类易溶于水，难溶于乙醇）；离心澄清步骤可去除样品中的不溶性杂质，减少背景干扰。

4.3 方法的优缺点

与HPLC相比，比色法具有操作简便、设备要求低、成本低廉等优势，适合基层实验室或批量样品的快速检测。但比色法的选择性较差，若样品中含有其他能与香草醛-浓硫酸反应的成分（如其他三萜皂苷），会导致结果偏高。因此，在实际应用中，需结合TLC或HPLC等方法进行定性确认，以提高检测的准确性。

5 结论

本文建立了甘草中甘草酸的香草醛-浓硫酸比色检测方法，该方法线性范围宽（0.02~0.1 mg/mL）、精密度好（RSD=0.62%）、准确性高（平均回收率=99.1%）、稳定性好（60 min内RSD=0.85%），符合分析方法的验证要求。该方法操作简便、成本低廉，可用于甘草药材及制品中甘草酸的快速检测，为甘草的质量控制提供了一种有效的技术手段。

参考文献

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（注：文中图表均为示意，实际实验需补充具体数据及图表。）