陆龟皮肤体外释放度测定（IVRT）方法的建立与应用

引言

透皮给药系统（Transdermal Drug Delivery System, TDDS）因具有避免肝脏首过效应、维持稳态血药浓度、提高患者依从性等优势，已成为现代药剂学的研究热点。体外透皮释放试验（In Vitro Release Testing, IVRT）作为TDDS质量控制的关键技术，用于评估药物从制剂载体中释放的速率和程度，是连接制剂工艺与体内药效的重要桥梁。

传统IVRT多采用人类尸体皮肤或动物皮肤（如猪、大鼠）作为透皮模型，但人类皮肤来源有限且存在伦理争议，动物皮肤（如猪皮）虽与人类皮肤结构相似，但获取成本较高。近年来，陆龟皮肤因具有角质层厚度适中、脂质组成与人类皮肤接近、来源相对容易等特点，逐渐成为IVRT的替代模型。本文旨在建立基于陆龟皮肤的IVRT方法，并探讨其在外用制剂评价中的应用。

材料与方法

1. 实验材料

1.1 陆龟皮肤

选取健康成年红腿陆龟（Chelonoidis carbonarius）背部皮肤（体重1.5-2.0 kg，无皮肤病损），处死后立即剥离背部皮肤，去除皮下脂肪及结缔组织，用磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）冲洗3次，滤纸吸干表面水分，装入密封袋，-20℃冷冻保存（保存期不超过1个月）。使用前于4℃解冻，用PBS平衡30 min。

1.2 试剂与供试品

• 接收介质：PBS（pH 7.4）含0.5% Tween 80（确保药物达到漏槽条件，即接收介质中药物浓度<10%饱和浓度）；
• 供试品：外用硝酸咪康唑软膏（规格：2%，基质为凡士林-羊毛脂混合物）、盐酸特比萘芬凝胶（规格：1%，基质为卡波姆-丙二醇）；
• 标准品：硝酸咪康唑（纯度≥98%）、盐酸特比萘芬（纯度≥99%）；
• 其他试剂：甲醇（色谱纯）、冰醋酸（分析纯）。

1.3 仪器

• Franz扩散池（供给室体积2.0 mL，接收室体积10.0 mL，有效扩散面积3.14 cm²）；
• 恒温水浴搅拌器（控温精度±0.1℃）；
• 高效液相色谱仪（HPLC，配备紫外检测器）；
• 皮肤电阻仪（用于检测皮肤完整性）；
• 电子分析天平（精度0.0001 g）。

2. 实验方法

2.1 皮肤完整性检查

解冻后的陆龟皮肤用皮肤电阻仪测定电阻值（电极间距1 cm），电阻>10 kΩ视为完整性良好（无破损）；同时用0.1%亚甲蓝溶液涂抹皮肤角质层表面，10 min后用PBS冲洗，若皮肤无蓝色渗透，进一步确认完整性。

2.2 Franz扩散池组装

将陆龟皮肤固定于Franz扩散池的供给室与接收室之间，角质层朝向供给室，确保皮肤与扩散池边缘紧密贴合（无气泡）。接收室加入预热至32℃的接收介质（模拟人体皮肤表面温度），液面与皮肤下表面接触。供给室加入供试品（软膏：100 mg，均匀涂铺于皮肤表面，厚度约0.5 mm；凝胶：50 mg，用玻璃棒涂布成均匀薄层），加盖防止水分蒸发。

2.3 释放试验条件

• 温度：32℃（恒温水浴循环）；
• 搅拌速度：500 rpm（保证接收介质均匀）；
• 取样时间点：0、1、2、4、6、8、12、24 h（预实验显示24 h内药物释放趋于平稳）；
• 取样与补样：每次从接收室取1.0 mL样品，立即补充1.0 mL预热至32℃的新鲜接收介质（维持接收室体积恒定）。

2.4 样品分析

• 硝酸咪康唑测定（HPLC）：色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%冰醋酸（75:25，v/v）；流速1.0 mL/min；检测波长230 nm；进样量20 μL。
• 盐酸特比萘芬测定（UV）：波长280 nm（最大吸收峰），用PBS（含0.5% Tween 80）作为空白对照，直接测定吸光度。

2.5 数据处理

• 累积释放量（Q，%）计算：
  $Q(t)=\genfrac{}{}{0ex}{}{C^i\times V+{\sum }^{j=1}{C}^j\times V^s}{W\times f}\times 100\%$
  其中，$C^i$为第$i$次取样的药物浓度（μg/mL）；$V$为接收室体积（10.0 mL）；$V^s$为每次取样体积（1.0 mL）；$W$为供试品中药物总量（μg）；$f$为供试品的标示含量（%）。

• 释放动力学分析：将累积释放量（Q）对时间平方根（$t^{1/2}$）作图，采用Higuchi模型（扩散控制释放）拟合，计算拟合度（$R^2$）及释放速率常数（$k^H$，μg·cm⁻²·h⁻¹/²）。

结果

1. 皮肤完整性

实验前所有陆龟皮肤的电阻值均>15 kΩ，亚甲蓝染色无渗透，表明皮肤完整性良好，可用于实验。

2. 释放曲线

硝酸咪康唑软膏与盐酸特比萘芬凝胶的累积释放曲线如图1所示。结果显示：

• 硝酸咪康唑软膏的释放速率较慢，24 h累积释放量为（45.2±3.1）%；
• 盐酸特比萘芬凝胶的释放速率较快，24 h累积释放量为（78.5±2.5）%。

3. 释放动力学

两种制剂的释放曲线均符合Higuchi模型（$R^2>0.98$），表明药物释放以扩散机制为主（表1）。盐酸特比萘芬凝胶的$k^H$（12.3±0.8 μg·cm⁻²·h⁻¹/²）显著高于硝酸咪康唑软膏（6.1±0.5 μg·cm⁻²·h⁻¹/²），与释放曲线结果一致。

4. 皮肤稳定性

实验后陆龟皮肤无明显肿胀、破损，亚甲蓝染色仍无渗透，表明皮肤在24 h试验中保持完整性，结果可靠。

讨论

1. 陆龟皮肤作为IVRT模型的优势

• 结构相似性：陆龟背部皮肤的角质层厚度（约20-30 μm）与人类手掌皮肤（约15-40 μm）接近，脂质组成（如神经酰胺、胆固醇）也与人类皮肤相似，有利于模拟药物在人类皮肤中的释放行为；
• 来源与伦理优势：陆龟为常见宠物，皮肤来源相对容易，且避免了人类尸体皮肤的伦理争议；
• 稳定性：陆龟皮肤的角质层较厚，实验中不易破损，重复性好（平行实验RSD<5%）。

2. 实验条件对释放度的影响

• 接收介质选择：0.5% Tween 80的加入显著提高了难溶性药物（如硝酸咪康唑）的溶解度，确保了漏槽条件；若未加表面活性剂，硝酸咪康唑的24 h累积释放量仅为（18.7±1.9）%，无法反映真实释放速率。
• 温度控制：32℃模拟了人体皮肤表面温度，温度升高（如37℃）会增加药物扩散速率，但可能导致皮肤结构破坏；温度降低（如25℃）则会减慢释放，影响结果准确性。
• 搅拌速度：500 rpm足以保证接收介质均匀，若搅拌速度过低（如200 rpm），会导致接收室底部药物浓度过高，形成浓度梯度，降低释放速率。

3. 陆龟皮肤的局限性

• 代谢差异：人类皮肤含有细胞色素P450等代谢酶，可代谢部分药物，而陆龟皮肤的代谢能力较弱，若药物需经皮肤代谢后吸收，结果可能与体内不符；
• 皮肤部位差异：陆龟背部皮肤与人类面部、腹部皮肤的角质层厚度仍有差异，对于需作用于薄皮肤部位的制剂（如眼用软膏），可能需要调整模型。

4. 结果解释

盐酸特比萘芬凝胶的释放速率显著高于硝酸咪康唑软膏，主要原因是凝胶基质（卡波姆-丙二醇）的亲水性更强，药物在基质中的扩散阻力更小；而软膏基质（凡士林-羊毛脂）的疏水性强，药物需突破脂质屏障才能释放，故速率较慢。这一结果与临床观察一致（凝胶制剂的起效速度通常快于软膏）。

结论

本研究建立了基于陆龟皮肤的IVRT方法，该方法操作简便、重复性好，可有效评估外用制剂的释放特性。陆龟皮肤作为替代模型，在结构相似性、来源便利性及伦理方面具有显著优势，可为外用制剂的工艺优化、质量控制提供可靠数据。后续研究可进一步比较陆龟皮肤与人类皮肤、猪皮肤的相关性，优化实验条件（如皮肤预处理方法、接收介质组成），拓展其在TDDS开发中的应用。

参考文献（略）
（注：文中数据为模拟结果，实际实验需根据具体药物调整条件。）