双水相提取检测

发布时间：2026-04-16 阅读量：10 作者：生物检测中心

双水相提取技术：原理、应用与检测方法

摘要： 双水相提取（Aqueous Two-Phase Extraction, ATPE）是一种利用两种互不相溶的水溶性聚合物或聚合物-盐溶液形成分层体系，实现生物分子或颗粒分离纯化的温和、高效分离技术。本文系统介绍双水相体系的形成原理、操作流程、在多个领域的应用实例、目标物检测方法以及技术展望。

一、 引言

在生物技术、制药、食品及环境工程等领域，高效、温和地分离纯化目标产物（如蛋白质、酶、核酸、病毒、天然产物等）至关重要。双水相提取技术因其操作条件温和（通常在室温、常压下进行）、生物相容性好、易于放大、分离效率高、环境友好等优点，成为一种极具吸引力的分离纯化手段。

二、 双水相体系形成原理

双水相体系的形成基于热力学不相容性原理。当两种不同的亲水性聚合物（如聚乙二醇 PEG 和葡聚糖 Dextran）或一种聚合物与一种高浓度盐（如 PEG 和磷酸盐、硫酸盐或柠檬酸盐）在水溶液中以特定浓度混合时，由于分子间的排斥作用（空间位阻、静电排斥等），体系无法维持均匀的单相状态，会自动分离成两个宏观上互不相溶的水相。

  • 主要体系类型：
    • 聚合物-聚合物体系 (如 PEG/Dextran)： 两相均富含聚合物和水，但浓度不同。上相通常富含低分子量聚合物（如 PEG），下相富含高分子量聚合物（如 Dextran）。界面张力极低（10⁻⁶ 至 10⁻⁴ mN/m）。成本相对较高。
    • 聚合物-盐体系 (如 PEG/盐)： 上相富含聚合物（如 PEG），下相富含盐和水。界面张力略高于聚合物-聚合物体系（10⁻⁴ 至 10⁻² mN/m）。成本较低，应用更广泛。
  • 相图： 描述特定聚合物或聚合物-盐组合形成双水相体系的浓度范围。相图由双节线（Binodal Curve）和系线（Tie Line）构成。双节线以上区域为两相区，以下为单相区。系线连接处于平衡状态的两个共轭相的组成点。系线长度反映两相性质的差异程度。
 

三、 双水相提取操作流程

  1. 体系配制： 根据相图或经验数据，精确称量或量取所需的聚合物、盐和水，置于容器中。
  2. 溶解与混合： 充分搅拌或振荡，使溶质完全溶解，形成均一溶液（单相状态）。
  3. 静置分相： 停止搅拌，静置一段时间（通常几分钟到几十分钟）。由于密度差和不相容性，溶液自发分层，形成清晰的两相界面。
  4. 样品加入与分配： 将含有目标物（如细胞匀浆液、发酵液、粗提物等）的样品加入配制好的双水相体系中。温和搅拌混合，使目标物在体系内充分接触。
  5. 再次静置分相： 再次静置，体系重新分层。目标物（蛋白质、细胞、颗粒等）会根据其自身的物理化学性质（如表面疏水性、电荷、分子量、大小、形状、生物亲和性等）选择性地分配进入其中一相（上相或下相），而杂质（细胞碎片、杂蛋白、核酸等）则主要分配至另一相或在界面处富集。
  6. 相分离与回收： 利用分液漏斗、离心分离管或专用设备，小心地将上下两相分开收集。
  7. 目标物回收与纯化： 从富含目标物的相中，进一步回收目标物。常用方法包括：
    • 稀释沉淀： 加入水或缓冲液稀释该相，降低聚合物浓度，使目标物沉淀析出，离心收集。
    • 超滤/透析： 利用超滤膜或透析袋去除聚合物和盐。
    • 层析： 作为初步纯化步骤，后续连接离子交换、凝胶过滤等层析进行精纯。
    • 盐析/沉淀： 向聚合物相中加入盐（如硫酸铵）沉淀目标物。
    • 加热/改变pH： 利用温度或pH变化诱导目标物沉淀（需确保目标物稳定性）。
  8. 聚合物回收（可选）： 对回收的聚合物溶液进行处理（如超滤、吸附、离子交换等），去除杂质以便循环使用，降低成本。
 

四、 目标物在两相中的分配行为

目标物在双水相体系中的分配系数（K）定义为：K = C<sub>top</sub> / C<sub>bottom</sub>，其中C<sub>top</sub>和C<sub>bottom</sub>分别是目标物在上相和下相中的浓度。K值决定了目标物主要存在于哪一相。

影响分配系数的主要因素：

  • 目标物性质： 分子量、等电点（pI）、表面电荷、表面疏水性、空间构象、生物特异性（如配体结合）。
  • 体系组成： 聚合物类型、分子量、浓度；盐的种类、浓度、离子强度；pH值（显著影响带电分子的分配）。
  • 环境因素： 温度。
  • 引入亲和配体： 在聚合物上共价连接特定的亲和配体（如染料、金属离子、抗体、底物类似物等），利用生物特异性相互作用，可显著提高目标物的分配系数和选择性。
 

五、 应用领域

双水相提取技术在多个领域展现出广泛的应用潜力：

  • 生物制药：
    • 蛋白质/酶纯化： 大规模纯化胞内酶（如脱氢酶、激酶）、干扰素、单克隆抗体片段、重组蛋白等。尤其适合作为细胞破碎后的第一步粗分离，有效去除细胞碎片。
    • 核酸分离： 纯化质粒DNA、基因组DNA、RNA。
    • 病毒颗粒/病毒样颗粒（VLP）纯化： 温和高效地分离疫苗用病毒或VLPs。
    • 抗生素提取： 从发酵液中提取某些抗生素。
  • 食品工业：
    • 天然产物提取： 从植物、藻类或微生物提取物中分离色素（如藻蓝蛋白、叶绿素）、抗氧化剂、风味物质、糖类等。
    • 酶制剂纯化： 食品级酶（如淀粉酶、蛋白酶、果胶酶）的分离纯化。
  • 环境工程：
    • 重金属离子去除： 利用功能化聚合物（如含螯合基团的PEG）选择性萃取废水中的重金属离子（如Cu²⁺, Cd²⁺, Pb²⁺）。
    • 有机污染物分离： 分离废水中的酚类、染料等有机污染物。
  • 细胞生物学：
    • 细胞器分离： 温和分离细胞膜、叶绿体、线粒体等细胞器。
    • 细胞分离： 分离不同类型或不同生理状态的细胞（如干细胞分选）。
 

六、 目标物检测方法

对双水相提取后的目标物进行准确定量分析是评估提取效率和纯化效果的关键。常用检测方法包括：

  1. 光谱法：
    • 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）： 用于检测具有特征紫外或可见光吸收的目标物，如蛋白质（280 nm）、核酸（260 nm）、某些色素（如藻蓝蛋白620 nm）。快速简便，是常规检测手段。
    • 荧光分光光度法： 用于检测具有天然荧光（如色氨酸、酪氨酸）或被荧光染料标记的目标物。灵敏度通常高于UV-Vis法。
    • 比色法： 基于目标物与特定试剂反应生成有色产物的原理进行定量，如BCA法、Lowry法、Bradford法测定蛋白质浓度。
  2. 色谱法：
    • 高效液相色谱法（HPLC）： 具有高分辨率和高灵敏度。反相色谱（RP-HPLC）常用于分析疏水性物质（如抗生素、多肽）；尺寸排阻色谱（SEC-HPLC）用于分析分子量大小和分布，评估纯度；离子交换色谱（IEX-HPLC）用于分析带电物质。
    • 高效毛细管电泳（HPCE）： 基于分子在电场中的迁移速率差异进行分离分析，样品和试剂消耗少，分辨率高，特别适合核酸、多肽、蛋白质的分析。
  3. 酶学分析法：
    • 对于酶类目标物，通过测定其催化特定底物转化的速率（酶活力）来定量。这是评估酶活性回收率和纯化倍数的关键指标。
  4. 免疫学分析法：
    • 酶联免疫吸附试验（ELISA）： 利用抗原-抗体特异性结合进行高灵敏度、高特异性的定量检测，特别适用于激素、抗体、病毒等具有抗原性的生物分子。
  5. 生物活性测定：
    • 对于抗生素、生长因子、疫苗等生物活性物质，需进行细胞培养或微生物实验来评估其生物活性。这是最终评价产物功能的关键步骤。
  6. 电化学分析法： 如离子选择性电极，用于特定离子（如重金属离子）的检测。
  7. 质谱法（MS）： 通常与色谱联用（如LC-MS），提供高灵敏度和高特异性的定性和定量信息，尤其适用于复杂基质中痕量化合物的分析、结构鉴定和纯度评估。
 

检测注意事项：

  • 基质效应： 双水相体系中的高浓度聚合物和盐可能干扰检测信号（如UV吸收背景升高、荧光淬灭、色谱柱污染、酶反应抑制）。通常需要稀释样品、沉淀目标物去除基质、使用合适的色谱柱保护柱或开发抗干扰的检测方法（如ELISA）。
  • 样品前处理： 根据检测方法要求对回收的目标物进行适当前处理（如稀释、脱盐、浓缩）。
 

七、 技术优势与挑战

  • 优势：
    • 操作条件温和，利于保持生物大分子和细胞的天然活性。
    • 处理容量大，易于放大（从毫升到立方米级），适合工业化应用。
    • 分离效率高，一步操作可同时实现浓缩和部分纯化（如去除细胞碎片）。
    • 生物相容性好，聚合物体系通常无毒或低毒。
    • 设备相对简单，能耗较低。
    • 可方便地与亲和配体结合，显著提高选择性。
    • 环境友好（水基体系）。
  • 挑战与局限：
    • 聚合物（尤其高分子量聚合物）成本相对较高（尽管可回收利用）。
    • 高粘度聚合物相可能导致传质速率降低和相分离时间延长。
    • 聚合物和盐的去除可能增加后续纯化步骤的复杂性和成本。
    • 分配行为受多种因素影响，体系优化（选择聚合物/盐类型、分子量、浓度、pH等）往往需要大量实验摸索。
    • 对于复杂混合物，单步分离的纯化倍数有时有限，常需与其他技术（如层析）联用。
    • 聚合物溶液的回收再利用工艺仍需完善。
 

八、 展望

双水相提取技术仍在不断发展中，未来的研究重点和趋势包括：

  1. 开发新型、低成本、高性能双水相体系： 如利用离子液体、低共熔溶剂（DES）、表面活性剂、可生物降解聚合物等构建新型双水相或浊点系统。
  2. 亲和双水相提取（Affinity ATPE）的深化应用： 设计合成更多样化、特异性更强的亲和配体，并将其高效、稳定地偶联到聚合物上，实现对目标物的高选择性识别与分离。
  3. 连续化、集成化工艺开发： 研究连续进料、混合、分相和产物回收的装置与流程，提高处理效率和自动化水平。将ATPE与其他单元操作（如细胞破碎、膜分离、层析）在线耦合，形成高效集成的生物分离流程。
  4. 基础理论研究深化： 利用分子模拟、热力学模型等更深入地揭示相形成机理和溶质分配规律，建立更精准的预测模型，指导实验设计和优化。
  5. 拓展应用领域： 在生物基化学品分离、纳米材料分离纯化、合成生物学产物分离等新兴领域寻找应用点。
  6. 绿色与可持续性： 强调聚合物和溶剂的可再生性、可生物降解性以及工艺过程的低能耗、低排放。
 

九、 结论

双水相提取技术作为一种高效、温和、可放大的分离纯化方法，在生物技术及相关领域展现出独特的优势。尽管面临成本、粘度和后续处理等挑战，但通过持续开发新型体系、优化工艺、深化基础研究和拓展应用领域，该技术有望在未来的生物制造、绿色分离和精准医学等领域发挥更重要的作用。其对生物活性物质的友好特性使其成为传统分离方法（如有机溶剂萃取）的重要补充和替代选择。

（注：本文内容基于公开发表的科学文献和技术资料整理，旨在提供技术性概述，不涉及任何具体企业或产品信息。）

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