游离脂肪酸（FFA）分析

游离脂肪酸（FFA）分析：从生理意义到检测技术

一、游离脂肪酸概述

游离脂肪酸（Free Fatty Acids, FFA），亦称非酯化脂肪酸（NEFA），指血浆或组织中未与甘油、胆固醇或其它醇类结合成酯的脂肪酸分子。它们主要来源于：

• 脂肪组织甘油三酯水解： 脂肪动员的核心产物。
• 循环脂蛋白（如乳糜微粒、VLDL）中甘油三酯水解： 主要在毛细血管内皮细胞表面经脂蛋白脂肪酶（LPL）催化释放。
• 膳食脂肪消化吸收： 少量短中链脂肪酸可直接吸收入门静脉循环。
• 肝脏合成： 主要在碳水化合物过量时进行。

FFA是机体重要的能量载体。在禁食或能量需求增加时，脂肪组织释放FFA入血，运输至心、肝、骨骼肌等组织进行β-氧化供能。同时，FFA也是重要的信号分子，参与调节胰岛素敏感性、炎症反应、胰高血糖素分泌等生理过程。

维持血浆FFA浓度在生理范围内至关重要。 持续高水平FFA与胰岛素抵抗、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、心血管疾病风险增加等密切相关。异常低水平FFA则可能反映能量储备耗竭或某些代谢紊乱。

二、FFA检测的临床与科研意义

准确测定FFA浓度具有广泛价值：

• 代谢紊乱评估： 监测肥胖、糖尿病、代谢综合征患者脂肪过度动员状态的核心指标。
• 心血管风险评估： 高FFA促进内皮功能障碍、炎症和血栓形成，是独立风险因子。
• 内分泌研究： 评估生长激素、儿茶酚胺、胰岛素、瘦素等激素对脂代谢的调控作用。
• 营养与能量代谢研究： 评估能量平衡状态、膳食干预效果、脂代谢通路功能。
• 药物研发与评价： 评估降脂药、胰岛素增敏剂、减肥药等对脂肪动员和FFA代谢的影响。
• 新生儿健康： 评估能量储备和代谢适应能力。

三、FFA分析主流技术

FFA分析面临挑战：浓度低（μM-mM范围）、种类多（链长/饱和度各异）、易受干扰、样本基质复杂（尤其是血清/血浆中的磷脂、甘油三酯）。常用方法如下：

1. 样品前处理：

   • 提取： 去除干扰物（甘油酯、磷脂、固醇酯），富集FFA。常用方法：
     • 有机溶剂萃取法： 如氯仿-甲醇（Folch或Bligh-Dyer法）提取总脂，再用硅胶柱层析分离FFA。
     • 固相萃取（SPE）： 使用特定吸附剂（如硅胶、氨丙基键合相）选择性吸附FFA或去除杂质。

2. 衍生化： 多数检测方法需将FFA转化为具有更强信号或更好分离特性的衍生物。

   • 目的： 提高挥发性（GC分析）、引入发色/荧光基团（比色/荧光法）、增强电离效率（MS检测）。
   • 常用衍生化试剂：
     • 酯化： 甲醇/浓硫酸（甲酯化，FAME，用于GC）、重氮甲烷（甲酯化）。
     • 酰化： 酰氯类（如对硝基苯甲酰氯、对溴苯甲酰氯，用于比色/荧光/HPLC-UV）。
     • 胺化： 荧光胺、丹磺酰肼（用于荧光检测）。

3. 核心检测技术：

   • 比色法/荧光法：
     • 原理： 基于酶促反应（如ACS-ACOD法）或化学衍生后显色/发光。
       • ACS-ACOD法（主流酶法）： 血清/血浆样本可不经提取直接测定。
         • FFA + CoA + ATP ⟶ Acyl-CoA + AMP + PPi （酰基辅酶A合成酶催化）
         • Acyl-CoA + O₂ ⟶ 2,3-Enoyl-CoA + H₂O₂ （酰基辅酶A氧化酶催化）
         • H₂O₂ + 4-AAP + TOOS ⟶ 醌亚胺染料（显色） （过氧化物酶催化）
     • 优缺点： 操作简便、成本较低、通量高，适合临床常规检测；但对不同链长FFA灵敏度可能有差异，易受溶血、脂血干扰。
   • 气相色谱法（GC）及气相色谱-质谱联用法（GC-MS）：
     • 原理： 样品经提取、甲酯化（FAME）后，利用GC根据脂肪酸甲酯的沸点和极性差异进行分离，通常用火焰离子化检测器（FID）或质谱（MS）检测。
     • 优缺点： 分离能力强，可同时定量多种单一FFA（链长分布、饱和度信息）；是测定短链脂肪酸的金标准；但样品前处理复杂、耗时，需衍生化。
   • 高效液相色谱法（HPLC）：
     • 原理： 分离未衍生或衍生化的FFA。常用反相色谱柱（如C18）。
     • 检测器：
       • 紫外/可见光（UV/Vis）： 通常需衍生化引入发色团（如对溴苯甲酰甲酯）。
       • 荧光（FLD）： 灵敏度高，通常需衍生化引入荧光基团（如丹磺酰肼）。
       • 蒸发光散射（ELSD）/ 质谱（MS）： 可检测未衍生FFA，但ELSD灵敏度、线性范围有限。
     • 优缺点： 可分离多种FFA；UV/Vis/FLD方法相对成熟；ELSD/MS无需衍生化；但灵敏度、分离度可能不如GC。
   • 液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）：
     • 原理： 目前最强大的技术。通常采用反相色谱分离，电喷雾电离（ESI⁻），三重四极杆质谱进行多反应监测（MRM）。
     • 优缺点： 灵敏度极高、特异性强、通量高、可同时精确定量多种单一FFA（包括位置/几何异构体）、通常无需衍生化或仅需简单衍生化；是科研首选；但仪器昂贵、方法开发复杂、运行维护成本高。

四、方法学选择考量

五、样本收集与处理的关键点

• 样本类型： 血清（常用）、血浆（推荐肝素钠或EDTA抗凝，避免枸橼酸盐抑制酶法）、组织匀浆液等。
• 空腹要求： 检测FFA通常要求至少8-12小时空腹，餐后FFA迅速下降且波动大。
• 快速处理： 血液样本应在采集后尽快（30-60分钟内）离心分离血清/血浆。 FFA在血细胞（尤其白细胞）酶作用下会持续代谢。
• 避免溶血和脂血： 溶血会释放干扰酶法测定的脂肪酸和酶；严重脂血可能导致物理干扰或非特异性反应。
• 低温保存：
  • 分离后的血清/血浆若不立即检测，应分装冻存于 -70°C至-80°C 最为理想。
  • 避免反复冻融。
  • 稳定性参考（-20°C条件下）：
    • 酶法：通常稳定数天至数周（不同研究报道不一，应尽快测定）。
    • 色谱/质谱法（经适当前处理）：稳定时间更长（数月）。
    • 冷冻组织样本应在液氮速冻后保存于-80°C。

六、质量控制与标准化

• 校准： 使用经认证的FFA混合标准品（如棕榈酸、油酸、硬脂酸等）。酶法常用已知浓度的FFA溶液（如棕榈酸）或配套校准品。
• 质控： 每批检测应包含高、低浓度质控品（商业质控品或实验室自制）。
• 干扰评估： 需评估溶血、脂血、黄疸、常见药物对所用方法的影响。
• 标准化： 不同方法（尤其是酶法试剂组分差异）结果可能存在偏差。LC-MS/MS正逐渐成为标准化参考方法。报告结果时应注明所用方法。

七、结果解读与参考范围

• 解读需结合临床背景： 如患者状态（空腹/餐后、应激、运动）、疾病、用药、其他代谢指标（血糖、胰岛素、血脂谱）。
• 典型参考范围（空腹成人，酶法）： 一般为 0.1 - 0.6 mmol/L 或 150 - 650 μEq/L。重要提示：
  • 范围受年龄、性别、BMI、检测方法影响显著。
  • 必须依据实验室建立或验证的本地参考范围进行解读。
• 异常情况：
  • 升高： 肥胖、未控制的糖尿病（尤其1型酮症倾向时）、长期饥饿/营养不良恢复期、肢端肥大症、库欣综合征、嗜铬细胞瘤、某些药物（如咖啡因、烟酸、肝素、β受体阻滞剂）、应激状态、酗酒、严重感染、肝素注射后（刺激LPL活性）。
  • 降低： 外源性高胰岛素血症（如胰岛素瘤、注射胰岛素后）、餐后状态、使用烟酸衍生物（抑制脂肪分解）、严重低血糖（抑制脂肪分解）、某些遗传性脂代谢障碍（罕见）。

八、未来发展趋势

• POCT（床旁检测）： 开发小型化、快速检测FFA的设备，用于糖尿病管理、运动医学等场景。
• 高通量LC-MS/MS平台： 进一步提高通量、降低成本，推动大规模人群研究和临床精准应用。
• 新型衍生化与分离技术： 探索更高效、特异、温和的衍生方法和具有更强分离能力的色谱材料。
• FFA动态监测： 结合连续血糖监测（CGM）概念，研究动态FFA监测技术。
• 单细胞FFA分析： 探索空间组学层面研究细胞异质性对FFA代谢的影响。
• 多组学整合分析： 将FFA谱数据与基因组学、转录组学、蛋白质组学等多维度数据整合，深入揭示FFA在复杂疾病中的作用网络。

总结： 游离脂肪酸分析是评估机体能量代谢稳态和多种疾病状态的关键工具。从经典的酶比色法到高精尖的LC-MS/MS技术，方法的选择取决于应用场景、所需信息（总FFA vs 单一FFA谱）、样本量和资源。严格规范的样本采集、处理、储存流程以及完善的质量控制体系是获得可靠结果的基础。正确解读FFA水平需结合临床背景和方法特异性参考范围。随着技术进步，FFA分析将朝着更高灵敏度、特异性、通量和便捷性的方向发展，为代谢健康和疾病研究提供更深入的洞见。