鼻腔、气管LPS滴注诱发急性支气管炎(小鼠/大鼠)

鼻腔/气管LPS滴注诱发急性支气管炎模型：核心检测项目详解

本方案详细阐述通过鼻腔滴注或气管内滴注脂多糖(LPS)诱导小鼠或大鼠急性支气管炎模型后，用于评估炎症程度和病理变化的核心检测项目。这些检测旨在全面表征模型的建立情况，为研究支气管炎的病理机制或药物干预效果提供依据。

一、 模型建立简述

1. 动物: 常用C57BL/6小鼠或SD/Wistar大鼠。根据实验目的选择年龄、性别匹配的动物，设置对照组(生理盐水滴注)和模型组(LPS滴注)。
2. LPS: 来源(如大肠杆菌O111:B4)、剂量(小鼠鼻腔：5-50μg/只；气管：10-100μg/kg；大鼠需根据体重调整，通常更高)、浓度和溶剂(常用无菌PBS或生理盐水)。
3. 滴注方法:
   • 鼻腔滴注: 动物轻度麻醉(如异氟烷)，仰卧固定，用微量移液器将LPS溶液(20-50μl)缓慢滴入一侧或双侧鼻孔，使其自然吸入。
   • 气管内滴注: 动物深度麻醉，仰卧固定于倾斜板，暴露声门，使用套管针或细导管将LPS溶液(小鼠~50μl，大鼠~100-200μl)直接注入气管。
4. 取材时间点: 根据研究目的选择，通常在滴注后6、12、24、48小时达到炎症高峰，24-48小时最常用。

二、 核心检测项目 (重点)

以下检测项目是评估LPS诱导急性支气管炎模型成功与否以及炎症程度的关键指标：

1. 支气管肺泡灌洗液分析 (Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF):

   • 目的: 直接评估气道腔内的炎症细胞浸润和部分可溶性介质水平。
   • 步骤: 动物安乐死后，暴露气管，插入套管，用无菌PBS进行灌洗并回收灌洗液。
   • 检测内容:
     • 总细胞计数: 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定BALF中的细胞总数，反映炎症细胞浸润的总体水平。模型组显著高于对照组。
     • 细胞分类计数 (Differential Cell Count):
       • 方法: BALF离心后，细胞沉淀涂片，进行瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色或Diff-Quik染色。
       • 计数: 在显微镜下计数至少200个细胞，区分并计算：
         • 中性粒细胞 (Neutrophils): LPS急性炎症的最显著特征。模型组比例急剧升高（常在70-90%以上）。
         • 巨噬细胞 (Macrophages): 常为对照组主要细胞，模型组比例相对下降。
         • 淋巴细胞 (Lymphocytes): 比例可能轻度升高。
         • 嗜酸性粒细胞 (Eosinophils): 在LPS诱导的急性模型中通常较少或没有明显升高（除非是慢性或过敏性模型）。
     • 上清液中炎症介质检测:
       • 方法: 离心去除细胞后的BALF上清液，保存于-80°C。
       • 检测指标 (常用ELISA或Multiplex Assay):
         • 促炎细胞因子: TNF-α, IL-1β, IL-6, KC/GRO-α (CXCL1, 啮齿类重要的中性粒细胞趋化因子)。
         • 趋化因子: MCP-1 (CCL2, 单核/巨噬细胞趋化), MIP-1α (CCL3), MIP-2 (CXCL2, 啮齿类中性粒细胞趋化因子)。
         • 其他: IL-17 (与中性粒细胞炎症相关)。

2. 肺组织病理学检查 (Histopathology):

   • 目的: 直观观察肺组织结构和炎症细胞在气道壁及肺实质的浸润情况，评估组织损伤程度。
   • 步骤:
     • 取材: 取肺组织（常取左肺或特定肺叶）。
     • 固定: 立即浸入足量10%中性福尔马林缓冲液中固定24-48小时。
     • 脱水、包埋、切片: 常规石蜡包埋，切成4-5μm厚切片。
     • 染色:
       • 苏木精-伊红染色 (Hematoxylin and Eosin, H&E): 最基础且必需的染色。
         • 观察：气道（支气管、细支气管）壁及周围组织炎症细胞（主要是中性粒细胞）浸润、血管充血、水肿、上皮损伤（脱落、坏死）、粘液分泌增加、管腔渗出物等。
       • 过碘酸-希夫染色 (Periodic Acid-Schiff, PAS): 评估杯状细胞增生和粘液分泌。
         • 观察：气道上皮中PAS阳性的杯状细胞数量是否增加，管腔内是否有PAS阳性粘液栓。是评估粘液高分泌的重要指标。
   • 病理评分 (Pathological Scoring): 对炎症程度进行半定量评估。
     • 常用评分系统(示例，可根据研究细化):
       • 气道炎症: 根据炎症细胞在支气管/细支气管壁及其周围组织的浸润范围和密度评分 (如：0=无；1=轻度；2=中度；3=重度)。
       • 上皮损伤: 根据上皮脱落、坏死程度评分。
       • 管腔渗出物/粘液: 根据管腔内炎性渗出物或粘液堵塞程度评分。
       • 血管周围炎症/水肿。
       • 总病理评分: 各项评分之和，用于组间比较。模型组评分显著高于对照组。评分需由至少两名对分组情况不知情的研究者独立进行。

3. 肺组织匀浆炎症因子检测:

   • 目的: 检测肺组织局部产生的炎症介质水平，反映组织整体炎症状态，与BALF互为补充。
   • 步骤: 取部分肺组织（常取右肺），称重后加入含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，冰上匀浆，离心取上清。
   • 检测指标: 同BALF上清液 (TNF-α, IL-1β, IL-6, KC/CXCL1, MCP-1等)。模型组水平显著升高。

4. 肺组织髓过氧化物酶活性 (Myeloperoxidase, MPO) 检测:

   • 目的: MPO主要存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中，是中性粒细胞浸润的特异性标志物。
   • 原理: MPO催化底物（如TMB或邻联茴香胺）产生有色产物，通过比色法测定活性。
   • 意义: 肺组织MPO活性水平直接反映组织内中性粒细胞浸润的数量和活化程度。模型组活性显著高于对照组。

三、 可选/延伸检测项目 (根据研究目的选择)

• 气道高反应性 (Airway Hyperresponsiveness, AHR): 使用无创或侵入性肺功能仪，通过雾化吸入乙酰甲胆碱等支气管收缩剂，测量气道阻力或肺顺应性变化。在急性LPS模型中，AHR可能轻度增加，但不如慢性哮喘模型显著。
• 氧化应激指标: 检测肺组织或BALF中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)等，评估氧化损伤程度。
• 粘液相关基因表达: qRT-PCR检测肺组织中粘蛋白基因(MUC5AC, MUC5B)的表达水平，补充PAS染色结果。
• 免疫组化/免疫荧光: 定位特定炎症因子、粘蛋白、炎症细胞标志物在肺组织中的表达位置和丰度。
• Western Blot: 检测肺组织中特定信号通路蛋白（如NF-κB p65, MAPK等）的活化水平。

四、 总结

鼻腔或气管滴注LPS是建立啮齿类急性支气管炎模型的经典方法，其特征是快速、强烈的中性粒细胞性气道炎症。核心检测项目聚焦于：

1. BALF细胞分析: 直接量化气道腔炎症细胞总数及中性粒细胞等关键亚型的比例。
2. 肺组织病理学(H&E和PAS染色): 直观评估炎症浸润、组织损伤和粘液分泌，结合病理评分进行半定量。
3. 炎症介质检测(BALF上清和肺匀浆): 定量分析促炎因子和趋化因子水平。
4. 肺组织MPO活性: 特异性反映中性粒细胞浸润程度。

这些检测相互印证，全面描绘了LPS诱导的急性支气管炎的病理生理特征：显著的中性粒细胞募集、强烈的局部炎症反应、气道上皮损伤以及粘液分泌增加。研究者应根据具体科学问题和实验设计，从核心项目中选择必需指标，并可酌情增加延伸项目以获得更深入的信息。严谨的对照组设置、标准化的操作流程（尤其是滴注剂量、取材时间和病理评分）是获得可靠结果的关键。

请注意： 所有动物实验必须遵循所在机构动物伦理委员会批准的方案进行操作。