多糖的分析方法与流程详解
一、 样品制备与预处理
-
提取：
- 溶剂提取： 常用热水、稀酸、稀碱或盐溶液提取。如热水提取适用于大多数中性多糖，稀碱常用于提取酸性多糖。
- 酶解法： 使用特定酶（如蛋白酶、淀粉酶）辅助去除杂质或提高提取效率。
- 超声/微波辅助提取： 利用物理场强化提取过程，提高效率、缩短时间。
- 其他： 超临界流体萃取等。
-
除杂与纯化：
- 脱蛋白： 常用Sevag法（氯仿：正丁醇=4:1）、三氯乙酸法、酶解法等去除蛋白质。
- 脱色素： 活性炭吸附、双氧水氧化、大孔树脂吸附等去除色素。
- 透析： 利用半透膜去除小分子杂质（如无机盐、单糖、寡糖）。
- 有机溶剂沉淀： 加入乙醇、丙酮等使多糖沉淀析出，是最常用的初步纯化方法。
- 色谱纯化：
- 离子交换色谱 (IEC)： 根据电荷差异分离酸性、中性或碱性多糖。
- 凝胶过滤色谱 (GFC)/尺寸排阻色谱 (SEC)： 根据分子大小和形状进行分离，常用于分级和分子量测定。
- 亲和色谱： 利用特异性结合（如凝集素）分离特定多糖。
- 冷冻干燥： 纯化后的多糖溶液常经冷冻干燥得到疏松粉末，便于保存和后续分析。
二、 理化性质分析
- 外观与溶解性： 观察颜色、形态，测试在水及不同有机溶剂中的溶解性。
- 比旋光度测定： 利用旋光仪测定多糖溶液的旋光度，可辅助判断单糖组成或构型。
- 纯度鉴定：
- 高效液相色谱 (HPLC)： 配示差折光检测器 (RID) 或蒸发光散射检测器 (ELSD)，观察色谱峰是否单一、对称。
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 或琼脂糖凝胶电泳： 观察条带是否单一。
- 紫外-可见光谱 (UV-Vis)： 检查在260nm（核酸）和280nm（蛋白质）附近是否有特征吸收峰，判断杂质残留情况。
- 比旋光度法： 纯多糖比旋光度恒定。
三、 分子量测定
- 凝胶过滤色谱/尺寸排阻色谱 (GFC/SEC)：
- 最常用方法。需使用已知分子量的标准多糖（如葡聚糖、支链淀粉系列）进行柱校准。
- 配备多角度激光光散射检测器 (MALS) 可绝对测定分子量及分子量分布。
- 配备示差折光检测器 (RID) 和粘度检测器 (Vis) 可联用测定特性粘度。
- 粘度法： 测定特性粘度
[η]，利用 Mark-Houwink 方程[η] = K * Mᵅ(K, α 为常数) 计算粘均分子量 (Mv)。需已知该多糖的 K 和 α 值。 - 光散射法：
- 静态光散射 (SLS)： 可测定重均分子量 (Mw) 和均方根旋转半径 (Rg)。
- 动态光散射 (DLS)： 测定流体力学半径 (Rh) 和分散度 (PDI)，推算分子量需模型假设。
- 超速离心法： 通过沉降速度或沉降平衡测定分子量，设备昂贵，操作复杂。
四、 单糖组成分析
- 酸水解： 多糖样品用强酸（如三氟乙酸、硫酸、盐酸）在严格控制的温度和时间下水解成单糖。
- 水解产物的衍生化与分离检测：
- 高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测 (HPAEC-PAD)： 可直接分析水解液中的中性单糖和酸性单糖，无需衍生，灵敏度高。
- 气相色谱 (GC) / 气相色谱-质谱联用 (GC-MS)： 水解后的单糖需衍生化（如硅烷化、乙酰化）增加挥发性。GC-MS可同时进行定性和定量。
- 高效液相色谱 (HPLC)： 水解单糖可进行柱前衍生（如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 (PMP) 衍生化），然后用紫外检测器检测。
五、 结构特征分析
- 糖苷键连接方式分析：
- 甲基化分析 (GC-MS)： 关键方法。多糖完全甲基化后水解，得到部分甲基化的单糖，乙酰化后通过GC-MS分析，确定各单糖残基的连接位点 (如1,4,6-三-O-乙酰基-2,3-二-O-甲基葡萄糖 表示该葡萄糖残基通过1,4,6位连接)。
- 高碘酸氧化与Smith降解： 高碘酸氧化断裂相邻且未被取代的邻二醇羟基连接的C-C键，通过测定消耗的高碘酸和生成的甲酸量，以及Smith降解产物（还原、酸水解）的分析，推断糖苷键位置和直链/支链结构。
- 核磁共振碳谱 (¹³C NMR)： 糖环上不同位置的碳原子化学位移不同，尤其是异头碳 (C1) 和连接位点的碳信号，可提供糖苷键类型 (α/β) 及连接位置的重要信息。
- 红外光谱 (FT-IR)： 提供官能团信息，如O-H伸缩振动 (~3400 cm⁻¹), C-H伸缩振动 (~2900 cm⁻¹), 羧基C=O伸缩振动 (1600-1730 cm⁻¹, 对于酸性多糖), 糖环特征吸收 (~1200-1000 cm⁻¹), 以及特定糖苷键的特征吸收 (如α-吡喃糖苷键在~840 cm⁻¹, β-吡喃糖苷键在~890 cm⁻¹)。
- 核磁共振波谱 (NMR)：
- 一维核磁： ¹H NMR (提供异头氢信号，判断α/β构型)，¹³C NMR (提供糖环碳信号，判断连接位置和类型)。
- 二维核磁： 解析复杂多糖结构的强大工具。
- COSY, TOCSY： 确定同一糖环内氢原子的耦合关系。
- HSQC, HMQC： 建立直接相连的碳原子和氢原子之间的关系。
- HMBC： 建立相隔两键或三键的碳原子和氢原子之间的关系，用于确定糖苷键的连接位点。
- NOESY, ROESY： 提供空间邻近信息，辅助确定连接顺序和构象。
- 序列分析： 对寡糖片段进行NMR或质谱分析以确定糖链中单糖的精确排列顺序。可使用部分酸水解、酶解（特异糖苷酶）或化学降解（如过乙酸氧化降解）产生寡糖片段。
六、 高级结构与构象分析
- X-射线衍射 (XRD)： 用于分析多糖晶体结构（如纤维素、甲壳素）。
- 原子力显微镜 (AFM)： 在近生理条件下直接观察多糖分子的形貌、聚集状态和高度。
- 圆二色谱 (CD)： 研究多糖溶液的构象变化，特别适用于含糖醛酸的多糖。
- 分子模拟： 结合实验数据（如NMR约束、XRD、粘度、光散射等），通过计算机模拟构建多糖的三维结构模型。
七、 生物活性评价 (根据研究目的选择)
- 体外抗氧化活性： DPPH自由基清除、ABTS自由基清除、羟自由基清除、超氧阴离子清除、还原力测定等。
- 免疫调节活性： 体外刺激免疫细胞（如巨噬细胞、淋巴细胞）增殖、分泌细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-1β等）；体内动物模型（如环磷酰胺诱导的免疫低下模型）评价。
- 抗肿瘤活性： 体外抑制肿瘤细胞增殖（MTT法、CCK-8法等）；体内动物移植瘤模型评价。
- 降血糖/降血脂活性： 体外抑制相关酶（α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、胰脂肪酶等）；体内糖尿病或高血脂动物模型评价。
- 其他： 抗凝血、抗病毒、益生元活性、保水保湿性等。
八、 质量控制指标
- 理化指标： 外观、溶解性、pH、干燥失重、灰分、比旋光度等。
- 含量测定：
- 总糖含量： 苯酚-硫酸法（最常用）、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法（适用于戊糖）。
- 糖醛酸含量： 间羟基联苯法（适用于不含中性糖干扰时）、咔唑-硫酸法、离子色谱法。
- 氨基葡萄糖含量（如甲壳素/壳聚糖）： 茚三酮法、酸水解后衍生化GC/HPLC法。
- 杂质限量检查：
- 蛋白质残留： Bradford法、Lowry法、BCA法、凯氏定氮法。
- 核酸残留： 紫外分光光度法（A260/A280）。
- 重金属残留： 原子吸收光谱法 (AAS)、电感耦合等离子体质谱法 (ICP-MS)。
- 微生物限度： 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌检查。
- 指纹图谱： 采用HPLC、GC或NMR等技术建立特征图谱，用于批次一致性和真伪鉴别。
总结：
多糖的分析是一个多步骤、多技术协同的过程。从提取纯化开始，经过理化性质、分子量、单糖组成、结构特征的逐层剖析，结合高级结构和生物活性评价，最终建立全面的质量控制体系。选择合适的分析方法组合取决于多糖的来源、性质以及具体的研究目的（基础研究或产品开发）。随着分析技术的不断进步（如更高灵敏度的质谱、更高分辨率的NMR、自动化平台），多糖的结构解析和功能研究将更加深入和高效。