Rag-1基因敲除小鼠

发布时间：2026-04-16 阅读量：18 作者：生物检测中心

Rag-1基因敲除小鼠：免疫缺陷研究的核心模型

Rag-1基因及其关键作用

Rag-1（Recombination-Activating Gene 1，重组激活基因1）与其配对基因Rag-2共同构成了适应性免疫系统发育的核心分子开关。它们编码的蛋白质形成复合物，作为特异性核酸酶，负责执行V(D)J重组这一关键过程。

  • V(D)J重组的本质： 这是T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR/抗体）基因在未成熟淋巴细胞（分别在胸腺和骨髓中）内发生的基因片段重排。基因组中包含多个不同的V（可变区）、D（多样性区）和J（连接区）基因片段。Rag复合物精准识别这些片段两侧的重组信号序列（RSS），切割DNA，形成双链断裂。
  • 后果与意义： 随后，细胞内的DNA修复机制（非同源末端连接，NHEJ）随机连接这些断裂的V、D、J片段。这种近乎随机的组合方式是产生天文数字级别（超过10¹¹种）的TCR和BCR多样性的根本机制，使得免疫系统有能力识别几乎无限种类的病原体（抗原）。没有Rag蛋白的功能，V(D)J重组无法启动，成熟的、具有功能的T细胞和B细胞就无法生成。
 

Rag-1基因敲除小鼠的构建

Rag-1⁻/⁻（通常简称为Rag KO）小鼠是通过现代基因工程（基因打靶）技术创造的：

  1. 靶向载体设计： 构建一个DNA载体，包含与小鼠基因组内源Rag-1基因特定区域同源的序列。该载体中，Rag-1基因的关键外显子（编码功能结构域的部分）通常被一个选择标记基因（如新霉素抗性基因neoʳ）所替换。
  2. 同源重组： 将该载体导入小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。通过细胞内的同源重组机制，载体上的修饰序列替换掉ES细胞染色体上对应的正常Rag-1基因序列。
  3. 筛选与验证： 利用药物筛选（如G418筛选带有neoʳ基因的细胞）和分子生物学技术（如PCR、Southern印迹）鉴定出成功发生同源重组的ES细胞克隆（即Rag-1基因被成功“敲除”的克隆）。
  4. 嵌合体小鼠与品系建立： 将筛选出的基因修饰ES细胞注入正常小鼠的早期胚胎（囊胚），移植入假孕母鼠体内发育。出生的嵌合体小鼠（部分细胞来自ES细胞，部分来自宿主胚胎）与野生型小鼠交配，其后代中可能产生生殖细胞携带敲除等位基因的个体（杂合子Rag-1⁺/⁻）。进一步将杂合子相互交配，即可获得纯合子Rag-1⁻/⁻基因敲除小鼠。
 

Rag-1⁻/⁻小鼠的表型：严重的联合免疫缺陷

Rag-1基因的缺失导致其蛋白功能完全丧失，产生以下显著且一致的免疫缺陷表型：

  1. 淋巴细胞发育阻滞：

    • T细胞： 在胸腺中，T前体细胞的发育被阻滞在CD4⁻ CD8⁻双阴性（DN）阶段（特别是DN3阶段），无法进行TCRβ链基因的重排和表达，因此不能形成pre-TCR信号，无法进一步分化为CD4⁺ CD8⁺双阳性（DP）细胞以及成熟的CD4⁺或CD8⁺单阳性T细胞。胸腺体积显著缩小，几乎没有成熟的T细胞输出到外周。
    • B细胞： 在骨髓中，B前体细胞的发育被阻滞在原B细胞（pro-B）到前B细胞（pre-B）的过渡阶段。无法进行免疫球蛋白重链（IgH）基因的有效重排和表达，因此不能形成pre-BCR信号，无法进一步分化为未成熟B细胞和成熟的B细胞。骨髓和外周淋巴器官（脾脏、淋巴结）中几乎检测不到成熟的B细胞（B220⁺ IgM⁺ IgD⁺）。

  2. 成熟T、B细胞缺失： 外周血、脾脏、淋巴结、肠道相关淋巴组织等中，成熟的、具有功能的T细胞（CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺）和B细胞（B220⁺, IgM⁺, IgD⁺）数量极低或完全检测不到。

  3. 体液免疫缺失： 由于缺乏成熟的B细胞，小鼠无法产生任何抗原特异性抗体（免疫球蛋白，包括IgM, IgG, IgA等）。血清中免疫球蛋白水平极低甚至检测不到。

  4. 细胞免疫缺失： 由于缺乏成熟的T细胞，小鼠缺乏细胞毒性T细胞（CTL）应答、辅助性T细胞（Th）应答以及调节性T细胞（Treg）功能。对依赖于T细胞的抗原刺激无法产生有效的免疫应答。

  5. 淋巴器官结构异常： 胸腺萎缩退化；脾脏和淋巴结结构紊乱，缺乏正常的滤泡（由B细胞构成）和胸腺依赖区（由T细胞构成），主要由基质细胞、巨噬细胞、树突细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK细胞）和粒细胞填充。派氏结等肠道相关淋巴组织发育不良或缺如。

  6. 对感染的极度易感性： Rag-1⁻/⁻小鼠对绝大多数病原体（病毒、细菌、真菌、寄生虫）都极度易感，即使是野生型小鼠通常能够抵御的条件致病菌感染也可能致命。它们无法清除感染，死亡率极高。

  7. 正常先天免疫细胞存在： 巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）的发育和数量基本不受影响（尽管某些活化可能因缺乏T细胞信号而受影响）。这些细胞构成了Rag-1⁻/⁻小鼠主要的免疫防御力量，但其功能不足以弥补T、B细胞缺陷导致的严重后果。

 

Rag-1⁻/⁻小鼠的核心应用领域

这种明确的、严重的免疫缺陷表型使Rag-1⁻/⁻小鼠成为免疫学研究中无可替代的工具：

  1. 适应性免疫机制研究：

    • V(D)J重组研究： 研究Rag蛋白功能、RSS识别、重组效率、重组方向性等机制的核心模型。
    • 淋巴细胞发育研究： 剖析T、B细胞发育各个阶段所需的信号通路（如pre-TCR, pre-BCR, Notch, 细胞因子信号等），明确特定发育检查点的作用。
    • 中枢与外周耐受机制研究： 研究胸腺内阴性选择、阳性选择过程，以及外周Treg细胞功能（通常需要在这些小鼠中重建免疫系统或过继转移特定T细胞亚群）。
    • 淋巴细胞活化与信号转导研究： 通过过继转移特定基因型的淋巴细胞，研究TCR、BCR下游信号通路的分子细节。

  2. 人类免疫缺陷疾病建模：

    • 严重联合免疫缺陷病（SCID）： Rag-1⁻/⁻小鼠是模拟人类因RAG1基因突变导致的SCID（Omenn综合征或典型SCID）的经典模型。用于研究疾病发病机制、免疫表型、潜在的治疗靶点（如基因治疗、造血干细胞移植HSCT的优化）。
    • 自身免疫与过敏性疾病机制： 通过移植来自特定自身免疫疾病模型小鼠或患者的免疫细胞/组织，可以研究特定淋巴细胞亚群在疾病发生中的作用，排除内源性淋巴细胞干扰。例如，研究致病性T细胞或B细胞如何驱动类风湿关节炎、系统性红斑狼疮或过敏反应。

  3. 肿瘤免疫学与免疫治疗研究：

    • 人源化小鼠模型构建： Rag-1⁻/⁻小鼠（尤其是与Il2rg基因敲除结合形成的NSG、NRG等更重度免疫缺陷品系的基础）是构建人源化小鼠（Humanized Mice）最常用的宿主。通过移植人源造血干细胞（HSC）或外周血单个核细胞（PBMC），或植入人源肿瘤组织（PDX模型），该类小鼠体内可以重建人源免疫系统或携带人源肿瘤，成为研究人类免疫应答、肿瘤-免疫相互作用、评估新型免疫疗法（如免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞、CAR-NK细胞、双特异性抗体、肿瘤疫苗、溶瘤病毒等）疗效和安全性的强大平台。
    • 同种/异种肿瘤移植模型： Rag-1⁻/⁻小鼠缺乏排斥反应，是移植同种（小鼠来源）或异种（人源）肿瘤细胞系建立移植瘤模型的理想宿主（如黑色素瘤细胞系B16-F10、结肠癌细胞系MC38、CT26等常用于免疫治疗研究的小鼠肿瘤模型）。广泛用于评估化疗药物、靶向药物以及免疫疗法的抗肿瘤效果和机制。

  4. 移植生物学研究：

    • 组织/器官移植： 缺乏T、B细胞使得Rag-1⁻/⁻小鼠对同种异体甚至异种移植物（如皮肤、胰岛、心脏等）的排斥反应显著减弱或延迟。被广泛用于研究移植排斥反应（特别是T细胞介导的排斥）的机制、评估免疫抑制方案的效果、以及探索诱导移植耐受的新策略（如调节性T细胞治疗）。
    • 造血干细胞移植（HSCT）： 是研究造血干细胞归巢、植入、分化、重建免疫功能以及移植物抗宿主病（GVHD）机制的重要模型（常与辐照等清髓预处理联合使用）。

  5. 传染病研究：

    • 病原体-宿主免疫互作机制： 通过过继转移特定的免疫细胞群体（如野生型T细胞、B细胞、基因修饰的细胞）到Rag-1⁻/⁻小鼠体内，然后进行病原体感染，可以精准地研究特定淋巴细胞亚群或其特定分子在抗感染免疫中的保护性或病理作用。
    • 慢性感染模型建立： 其免疫缺陷状态允许某些在野生型小鼠中会被快速清除的病原体建立慢性感染，用于研究慢性感染的免疫病理机制和持久性控制策略。

  6. 新型疗法安全性与有效性评估：

    • 生物制剂/细胞治疗安全性： 用于评估治疗性抗体、重组蛋白、基因治疗载体、工程化细胞（如CAR-T）等的潜在免疫原性、毒性以及药代动力学特性。
    • 人类细胞/组织移植的安全性评估： 在临床前研究中测试基于人类干细胞或组织衍生产品的安全性和成瘤性潜力。
 

Rag-1⁻/⁻小鼠的局限性

虽然极其强大，但该模型也存在一些局限性：

  1. 存在先天免疫细胞： NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等先天免疫细胞的存在可能影响某些实验结果，尤其是在研究肿瘤免疫或移植排斥时，它们可能介导残余的排斥反应或抗肿瘤效应（尽管相对于T/B细胞作用较弱）。
  2. “渗漏”现象： 极少数情况下，极少量功能异常的成熟淋巴细胞可能逃过发育阻滞，但通常不影响整体严重免疫缺陷的表型和应用。
  3. 无法模拟所有人类SCID类型： 仅模拟由RAG1缺陷引起的SCID亚型。其他原因（如IL2RG缺陷、ADA缺陷等）导致的SCID需要不同的基因工程小鼠模型。
  4. 微生物控制要求高： 由于其严重免疫缺陷，必须在严格的无特定病原体（SPF）屏障环境下饲养和实验，以防止机会性感染导致动物死亡和实验结果偏差。维护成本较高。
 

总结

Rag-1基因敲除小鼠因其成熟T、B淋巴细胞完全缺失的明确且严重的免疫缺陷表型，已成为免疫学基础研究和转化医学研究中不可或缺的标准实验动物模型。它在揭示淋巴细胞发育分化机制、模拟人类免疫缺陷疾病、建立肿瘤和移植研究模型、评估新型免疫疗法和生物制剂等方面发挥着核心作用。尽管存在先天免疫细胞存在等局限性，但其在精准解析适应性免疫功能方面的价值无可替代。随着免疫治疗等领域的飞速发展，Rag-1⁻/⁻小鼠及其衍生的更重度免疫缺陷模型（如Rag-1⁻/⁻ Il2rg⁻/⁻）将继续是推动生命科学和医学进步的关键工具。

主要参考文献：

  • Mombaerts, P., et al. (1992). RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell, 68(5), 869–877. (奠基性论文)
  • Shinkai, Y., et al. (1992). RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell, 68(5), 855–867. (奠基性论文)
  • Bosma, G. C., & Carroll, A. M. (1991). The SCID mouse mutant: definition, characterization, and potential uses. Annual Review of Immunology, 9, 323–350. (关于SCID小鼠的经典综述，Rag KO是其遗传背景清晰的版本)
  • Shultz, L. D., et al. (2012). Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature Reviews Immunology, 12(11), 786–798. (详述人源化小鼠模型，Rag KO是构建基础)
  • Walsh, N. C., et al. (2017). Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 12, 187–215. (应用综述)
  • Ito, R., et al. (2019). Current advances in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology, 16(5), 445–451. (最新进展)
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