HILIC-UHPLC分析N-聚糖键

HILIC-UHPLC分析N-聚糖：原理、方法与应用

一、引言

N-聚糖作为糖蛋白重要的翻译后修饰，其结构异质性直接影响蛋白质的稳定性、活性、免疫原性及药代动力学特性，尤其在治疗性糖蛋白药物（如单克隆抗体、融合蛋白）和生物标志物研究中至关重要。因此，发展高分辨率、高灵敏度的N-聚糖分离分析技术是糖科学领域的核心需求。基于亲水相互作用液相色谱（HILIC）与超高效液相色谱（UHPLC）联用（HILIC-UHPLC）的技术，凭借其卓越的分离能力、快速的分析速度和良好的重现性，已成为复杂N-聚糖混合物表征的“金标准”。

二、HILIC-UHPLC技术原理

1. 亲水相互作用色谱（HILIC）：

   • 分离机制： HILIC基于分析物在亲水性固定相表面富集的水层与流动相有机溶剂之间的分配差异进行分离。固定相表面形成的水合层与极性的N-聚糖分子发生亲水相互作用。
   • 聚糖适用性： N-聚糖具有丰富的羟基、乙酰氨基等强极性基团，与HILIC固定相（如酰胺基、二醇基、zwitterionic基团）相互作用强烈。分离顺序通常遵循极性/亲水性原则：单糖 < 二糖 < 寡糖，相同聚合度下，中性糖 < 唾液酸化糖 < 岩藻糖基化糖（通常，具体顺序受固定相和流动相影响）。
   • 流动相： 典型流动相为高比例有机相（乙腈通常占60-90%）和低比例水相（含挥发性缓冲盐如甲酸铵、乙酸铵）的梯度洗脱系统。初始高有机相条件使聚糖保留在柱头，随着水相比例增加，聚糖按其亲水性递减的顺序被洗脱。

2. 超高效液相色谱（UHPLC）：

   • 核心优势： UHPLC使用亚微米级粒径（通常1.7 µm或更小）的色谱柱填料和优化的系统（高压输液泵、低扩散检测池、快速采样检测器），显著提升了分离效率和分析速度。
   • 对HILIC的增强：
     • 更高柱效： 小粒径填料大大增加了理论塔板数，显著改善了对结构极其相似的同分异构体N-聚糖（如不同唾液酸连接方式α2-3 vs α2-6，不同半乳糖位置）的分离能力。
     • 更快分析： 在保证分离度的前提下，分析时间可缩短至传统HPLC的1/3甚至更短（通常10-30分钟内完成复杂聚糖分离）。
     • 更高灵敏度： 更窄的峰宽减少了峰扩散，提高了峰高和信噪比。
     • 更低溶剂消耗： 更小的柱内径和更短的运行时间显著降低了溶剂用量，更经济环保。

三、N-聚糖HILIC-UHPLC分析流程

1. 样品前处理 (关键步骤)：

   • 酶解释放： 使用肽-N-糖苷酶F（PNGase F）在非还原条件下（通常在变性剂如SDS、NP-40存在下）将N-聚糖从糖蛋白主链上完整释放出来。对于含有α1,3-核心岩藻糖的植物或昆虫来源糖蛋白，可能需要PNGase A。
   • 除盐与纯化： 释放的聚糖需去除蛋白质、盐分、变性剂等干扰物。常用方法包括：固相萃取（SPE，如石墨化碳柱、亲水亲脂平衡柱）、透析、蛋白质沉淀（冷乙醇/丙酮）结合离心过滤。
   • 荧光标记 (推荐)：
     • 目的： N-聚糖本身缺乏强紫外或荧光吸收基团。标记可极大提高检测灵敏度（尤其对于低丰度聚糖），并改善色谱行为（减少拖尾）。
     • 常用标记物： 2-氨基苯甲酰胺（2-AB）、2-氨基吡啶（2-AP）、2-氨基吖啶酮（2-AA）、Procamide等。
     • 反应： 通过还原胺化反应，标记物的伯氨基与聚糖还原端的醛基形成稳定的席夫碱连接。

2. 色谱条件优化：

   • 色谱柱选择： 常用酰胺基键合固定相或zwitterionic亲水相互作用色谱（ZIC-HILIC）固定相。色谱柱规格通常为100 mm x 2.1 mm内径，填料粒径1.7 µm或1.8 µm。
   • 流动相：
     • A相： 高比例乙腈（如90-95%）。
     • B相： 含挥发性缓冲盐（如10-200 mM甲酸铵或乙酸铵）的水溶液，pH通常调节至4.0-4.5（甲酸调节）以优化分离和质谱兼容性。
   • 梯度程序： 起始高比例A相（如85-90%），线性或非线性梯度增加B相比例（如降至60-70% A相），平衡时间需充分保证重现性。梯度斜率、初始和最终有机相比例需根据聚糖复杂度和目标分离度优化。
   • 柱温： 通常在30-60°C范围内优化。升高温度可降低流动相粘度，提高柱效和分离速度，但可能影响某些聚糖异构体的分离选择性。
   • 流速： 0.3 - 0.6 mL/min（取决于柱规格和系统压力上限）。
   • 进样量： 根据样品浓度和检测器灵敏度，通常1-10 µL。

3. 检测：

   • 荧光检测 (FLD)： 标记聚糖的首选检测方式，灵敏度高（可达fmol级），选择性好。需根据标记物选择最佳激发/发射波长（如2-AB：λ_ex = 330 nm, λ_em = 420 nm）。
   • 质谱检测 (MS)： 常与FLD联用（通常分流或切换），用于聚糖结构确证。HILIC流动相的高有机相和挥发性缓冲盐与电喷雾电离（ESI）兼容性好，常用负离子模式检测（尤其含唾液酸聚糖）。提供精确分子量信息（确定单糖组成）和碎片离子信息（推断连接和分支）。
   • 蒸发光散射检测 (ELSD) / 电雾式检测 (CAD)： 通用型检测器，无需衍生化，但灵敏度通常低于荧光检测，且响应因子因聚糖结构而异，定量准确性相对较低。

4. 数据处理：

   • 定性： 基于保留时间（与标准品或已知聚糖库比对）、荧光特征和质谱数据（精确质量数、MS/MS碎片）进行峰识别。使用葡萄糖单位值（GU）进行保留时间标准化有助于不同实验室间数据比较。
   • 定量： 通常基于荧光峰面积进行相对定量（计算各聚糖峰占总峰面积的百分比）。需验证方法的线性、精密度、准确度和检测限/定量限。

四、方法优势与应用

1. 核心优势：

   • 卓越的分辨率： 能有效分离结构极其相似的中性、唾液酸化、岩藻糖基化N-聚糖异构体（如同分异构体、不同分支数）。
   • 高灵敏度与选择性： 荧光标记结合UHPLC使痕量聚糖分析成为可能。
   • 快速高效： 显著缩短分析时间，提高通量。
   • 良好的重现性： 柱效高、系统稳定，保证批次内和批次间结果可靠。
   • 质谱兼容性好： 流动相易于挥发，适合在线LC-MS联用进行结构解析。
   • 相对标准化： GU值系统便于不同平台间数据比较和数据库共享。

2. 主要应用领域：

   • 生物制药：
     • 治疗性抗体（mAb）、重组蛋白、疫苗等的糖基化表征与质控（批间一致性、关键质量属性CQA监测）。
     • 生物类似药与原研药的糖基化相似性评估。
     • 工艺开发与优化（细胞培养条件、纯化工艺对糖型的影响）。
   • 疾病生物标志物研究： 寻找血清、组织等样本中与癌症、炎症、遗传病等相关的异常糖基化标志物。
   • 基础糖生物学研究： 研究糖基转移酶/糖苷酶的功能、糖基化途径调控、糖蛋白结构与功能关系。
   • 食品科学： 分析乳制品、蜂蜜等食品中的功能糖蛋白或寡糖。

五、注意事项

1. 前处理至关重要： 聚糖释放效率、纯化效果和标记效率直接影响最终结果。需严格优化和控制。
2. 梯度平衡： HILIC色谱柱在梯度运行后需要足够长的平衡时间（通常10-15倍柱体积或更长时间）以恢复初始条件，确保保留时间的重现性。这是HILIC重现性的关键。
3. 缓冲盐浓度与pH： 缓冲盐浓度和pH值显著影响聚糖保留、分离选择性和质谱信号。需仔细优化。
4. 荧光猝灭： 某些聚糖（特别是含唾液酸）在高浓度乙腈下可能发生荧光猝灭效应，影响定量准确性，需评估或在方法开发中注意。
5. 标准品与数据库： 缺乏商业化的完整N-聚糖异构体标准品是挑战。依赖GU数据库和LC-MS/MS进行结构推定。

六、结论

HILIC-UHPLC技术结合了亲水相互作用对极性聚糖的优异选择性和UHPLC平台的高效、高速、高灵敏度优势，为复杂N-聚糖混合物的高分辨率分离分析提供了强大而可靠的解决方案。其在生物制药质量控制、疾病标志物发现和基础糖科学研究中发挥着不可替代的作用。通过严谨的样品前处理、优化的色谱条件和适当的检测手段（尤其是荧光与质谱联用），研究者能够深入解析糖蛋白的微观不均一性，揭示糖基化在生命活动和疾病治疗中的关键意义。随着色谱柱技术、仪器性能和数据处理算法的持续进步，HILIC-UHPLC在N-聚糖分析领域的重要性将进一步提升。