蛋白质纯度和均一性表征

蛋白质纯度和均一性表征：关键技术与策略

蛋白质作为生命活动的主要执行者，其质量在生物医药、生物技术和基础研究中至关重要。纯度和均一性是评估蛋白质样品质量的核心指标，直接影响其功能研究、结构解析及临床应用的安全性与有效性。本文将系统介绍这两大关键属性的定义、评估方法及综合策略。

一、概念解析

• 纯度： 指目标蛋白在样品总量中所占的百分比，反映样品中目标蛋白与非目标杂质（如宿主细胞蛋白、核酸、内毒素、其他杂蛋白、降解片段等）的比例关系。
• 均一性： 指目标蛋白分子在结构、翻译后修饰和聚集状态等方面的一致性程度。一个均一的样品意味着其中绝大多数蛋白质分子具有相同的：
  • 一级结构： 氨基酸序列正确无误。
  • 高级结构： 正确折叠成特定的三维构象。
  • 翻译后修饰： 如糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰的类型、位点和程度一致。
  • 聚集状态： 以单体或特定寡聚体形式存在，无显著聚集或降解。

二、核心表征技术

蛋白质纯度和均一性的评估是一个多层次、多技术的综合过程，没有单一方法能提供所有信息。常用技术包括：

1. 色谱法： 基于物理化学性质差异进行分离和分析。

   • 反相色谱： 基于疏水性差异。高分辨率分离目标蛋白与杂质（如降解片段、疏水性杂质），是检测化学降解（脱酰胺、氧化）和评估纯度的重要工具。
   • 离子交换色谱： 基于表面电荷差异。可分离电荷异构体（如不同修饰状态、降解状态）和评估电荷均一性。
   • 尺寸排阻色谱： 基于分子大小和流体力学体积差异。是评估大小均一性的金标准方法：
     • 检测高分子量物质：聚集体（二聚体、多聚体）。
     • 检测低分子量物质：降解片段、非共价结合的小分子杂质。
     • 提供样品中单体、聚集体、片段的相对含量信息。
   • 疏水相互作用色谱： 基于表面疏水性差异。对检测疏水性变体（如错误折叠、部分展开）敏感。
   • 亲和色谱： 基于特异性生物相互作用。常用于特定目标蛋白的纯化，也可用于检测纯度和结合活性相关的均一性。

2. 电泳法： 基于电荷、大小或等电点差异进行分离。

   • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳： 基于分子量大小分离变性蛋白。主要用于：
     • 评估纯度：检测非目标蛋白条带。
     • 初步评估大小均一性：检测降解或异常迁移。
     • 需结合染色技术（考马斯亮蓝、银染）或Western Blot进行检测。
   • 毛细管电泳： 在细内径毛细管中进行高效分离。包括多种模式：
     • CE-SDS： 类似SDS-PAGE，但分辨率更高、定量更准确、自动化程度高，是生物药纯度分析的常用方法。
     • cIEF： 毛细管等电聚焦。基于等电点分离，是评估电荷异质性（不同糖型、酸性/碱性峰、脱酰胺、唾液酸化等）的最灵敏方法之一。
   • 等电聚焦/双向电泳： 基于等电点和分子量的二维分离，可高分辨率展示蛋白的电荷和大小异质性，但通量较低。

3. 光谱法：

   • 紫外-可见光谱： 测量特定波长下的吸光度。常用A280nm定量蛋白质浓度，A260/A280比值可粗略指示核酸污染程度。
   • 圆二色谱： 测量蛋白质在远紫外区的圆二色性信号，反映主链构象，是评估二级结构均一性/正确性的重要方法。
   • 荧光光谱： 利用内源荧光（色氨酸、酪氨酸）或外源荧光探针，可探测蛋白质折叠状态、构象变化及聚集倾向。

4. 质谱法： 提供高分辨、高灵敏度的分子量信息和结构信息。

   • 完整蛋白分子量测定： 精确测定分子量，确认氨基酸序列是否正确，检测是否存在大规模修饰或降解。
   • 肽图分析： 蛋白酶解后，通过液相色谱串联质谱分析肽段混合物。是评估序列一致性、确认修饰位点和类型的金标准。能精确检测点突变、修饰异质性（如糖基化位点占有率、糖型）、降解（如脱酰胺、氧化）。
   • 自上而下/中而下质谱： 直接分析完整蛋白或较大片段，提供更全面的修饰和序列覆盖信息。

5. 生物活性测定： 通过细胞实验、酶学实验或受体结合实验等，评估蛋白质的功能均一性。这是证明蛋白质正确折叠并具有预期生物效应的最直接证据。

三、综合策略与流程

1. 目标导向： 根据蛋白质的用途（研究试剂、诊断试剂、治疗药物）和应用场景（如给药途径），设定适当的纯度和均一性标准。治疗用蛋白的要求远高于研究用蛋白。
2. 层次化分析：
   • 纯度初筛： SDS-PAGE/Coomassie染色、SEC（紫外检测）、A260/A280。
   • 深入表征： CE-SDS（纯度/大小异质性）、cIEF（电荷异质性）、RP-HPLC（纯度/化学降解）、生物活性测定。
   • 结构确证与修饰分析： 肽图分析（LC-MS/MS）、完整分子量测定（MS）、圆二色谱/荧光光谱（高级结构）。
   • 聚集状态分析： SEC（多角度光散射检测可提供绝对分子量）、动态光散射、分析型超速离心。
3. 正交互补： 不同技术原理相互补充、验证结果。例如：SEC检测到的小峰，可用CE-SDS或MS确认其性质；cIEF检测的电荷变体，可用肽图分析鉴定具体修饰位点。
4. 稳定性监测： 将表征贯穿于生产、纯化、制剂、储存和运输的全过程，监测关键质量属性随时间或环境条件的变化。

四、重要性

• 基础研究： 确保实验结果可靠、可重复，避免杂质干扰对机制研究的误导。
• 诊断应用： 保证检测试剂的灵敏度、特异性和稳定性。
• 生物制药： 至关生命！ 高纯度和均一性是确保药物安全性（降低免疫原性风险）、有效性（保证预期生物活性）和批间一致性的核心要求。监管机构对此有严格规定。

结论：

蛋白质纯度和均一性的表征是一项复杂而精密的工作，需要根据蛋白质的具体特性和应用目的，科学选择和组合多种分析技术。通过系统的、多层次的、正交互补的分析策略，才能全面、准确地评估蛋白质样品的质量属性，确保其在科学研究、诊断和治疗中发挥预期作用并满足严格的法规要求。持续的技术创新和方法优化是提升蛋白质表征能力和质量保证水平的关键。

附录：关键质量属性与常用表征技术对照表

HCP: 宿主细胞蛋白; DNA: 脱氧核糖核酸; LAL: 鲎试剂法; DLS: 动态光散射; AUC: 分析型超速离心; PTM: 翻译后修饰; HILIC: 亲水相互作用色谱.