Hipp11位点插入过表达人源LDLR小鼠

发布时间：2026-04-16 阅读量：36 作者：生物检测中心

Hipp11位点介导的人源LDLR过表达小鼠模型构建及其应用研究

摘要：
本研究利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复技术，成功将包含人源低密度脂蛋白受体基因的全长cDNA表达框精准插入小鼠基因组中的Hipp11安全港位点，构建了稳定过表达人源LDLR的基因工程小鼠模型。该模型克服了传统随机插入转基因小鼠表达不稳定、位置效应强及内源基因潜在干扰等局限，为研究人LDLR功能、相关脂质代谢疾病的病理机制及新型降脂疗法的临床前评估提供了高度可靠且可遗传的工具。

引言
低密度脂蛋白受体在维持机体胆固醇稳态中扮演核心角色，其功能缺陷或表达不足是导致家族性高胆固醇血症及动脉粥样硬化等重大疾病的关键因素。传统转基因小鼠模型存在表达不可控、遗传背景复杂等问题。高精度基因插入位点因其可预测的表达模式、稳定的遗传特性及对宿主基因组的低风险干扰，成为构建理想基因工程模型的新策略。本研究选择公认的小鼠安全港位点Hipp11作为靶点，旨在构建表达人源LDLR、遗传背景清晰且表型稳定的新型小鼠模型。

材料与方法

  1. 靶向载体构建：

    • 设计并合成包含两侧同源臂（长度约为800-1000bp，精确匹配Hipp11位点上下游序列）的靶向载体。
    • 载体核心包含：强效通用启动子（如CAG）、完整的人LDLR cDNA编码序列（GenBank参考序列）、多聚腺苷酸信号序列及两侧必要的酶切位点。
    • 载体中包含位于同源臂外侧、用于阳性筛选的短效标记基因（如floxed neo或puromycin抗性基因）。

  2. sgRNA设计与制备：

    • 针对Hipp11位点设计特异性高、脱靶风险低的单链向导RNA序列。
    • 通过体外转录合成高纯度sgRNA。

  3. CRISPR/Cas9系统递送与显微注射：

    • 将纯化的Cas9 mRNA、特异性sgRNA及线性化的靶向载体共同注射入C57BL/6J小鼠受精卵原核。
    • 注射后的受精卵体外培养至囊胚期。

  4. 胚胎移植与子代基因型鉴定：

    • 将健康囊胚移植入假孕母鼠子宫。
    • 出生子鼠（F0代）通过尾尖基因组DNA PCR进行初步筛选。
    • 利用针对插入位点两侧及人LDLR基因的特异性引物进行PCR鉴定，并通过Southern Blotting验证插入的精确性、完整性和单拷贝性。
    • 筛选出正确靶向的F0代嵌合体小鼠。

  5. 小鼠繁育与品系建立：

    • F0嵌合体与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得F1代杂合子小鼠。
    • 筛选去除筛选标记基因（若使用Cre-loxP系统，则需与表达Cre重组酶的小鼠交配）。
    • F1代杂合子小鼠互交，获得F2代纯合子小鼠（LDLR-Hipp11-Tg/LDLR-Hipp11-Tg），并通过PCR及测序确认基因型。

  6. 人源LDLR表达与功能验证：

    • mRNA水平： 采用实时荧光定量PCR检测肝脏、肾上腺等重要代谢器官中人LDLR mRNA的表达丰度及其组织分布特异性。
    • 蛋白水平： 应用蛋白质印迹、免疫组织化学/免疫荧光技术检测人LDLR蛋白的表达水平、细胞定位（主要集中于肝细胞膜）。
    • 功能验证：
      • 离体细胞结合/内吞实验：分离原代肝细胞，检测其对荧光标记或放射性标记LDL颗粒的结合与内吞能力。
      • 体内血脂谱分析：定期监测纯合子转基因小鼠及同窝野生型对照小鼠在基础状态和高脂饮食诱导下的血浆总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯水平。
      • 清除率试验：静脉注射荧光标记或放射性标记的LDL，测定其在血浆中的清除速率。
 

结果

  1. 高效精准靶向： CRISPR/Cas9系统成功介导了人LDLR表达框在Hipp11位点的精确整合。Southern Blotting证实为单拷贝正确插入。F0代嵌合体小鼠出生率良好。
  2. 稳定遗传与品系纯化： 成功获得并繁殖出F1和F2代转基因小鼠。PCR和测序结果显示人LDLR基因稳定遗传，并成功建立了纯合子转基因品系。
  3. 强效稳定表达：
    • qPCR结果显示，纯合子转基因小鼠肝脏中人LDLR mRNA表达水平显著高于野生型小鼠。
    • 蛋白质印迹和免疫组化显示，人源LDLR蛋白在转基因小鼠肝脏中高水平特异性表达，主要定位于肝细胞膜，表达水平在不同个体间高度一致。
  4. 功能性人LDLR表达：
    • 转基因小鼠原代肝细胞表现出显著增强的对标记LDL的结合和内吞能力。
    • 在基础饲喂条件下，纯合子转基因小鼠血浆总胆固醇和LDL-C水平显著低于同窝野生型对照小鼠。
    • 静脉注射标记LDL后，转基因小鼠血浆中LDL的清除速率明显快于野生型小鼠，证实受体功能活性增强。
    • 给予高脂饮食后，转基因小鼠显示出抵抗饮食诱导的高胆固醇血症的能力，血脂升高幅度显著低于野生型小鼠。
 

讨论
本研究成功构建了在Hipp11安全港位点特异性过表达功能性人源LDLR的转基因小鼠模型。该模型的核心优势在于：

  • 表达稳定性与可预测性： 得益于安全港位点的特性，人LDLR的表达水平稳定、一致，且不受随机插入带来的位置效应影响，避免了传统转基因动物常见的表达沉默或异位表达问题。
  • 生理病理相关性增强： 人源LDLR的表达更贴近于研究人体内的真实情况，克服了小鼠与人LDLR功能细节差异可能带来的偏差，显著提升了模型在转化医学研究中的价值。
  • 规避内源基因干扰： 此策略未干扰小鼠内源性Ldlr基因位点，小鼠自身Ldlr基因表达不受影响，保留了完整的背景生理状态。这不同于Ldlr敲除或人源化敲入模型，排除了内源基因完全缺失或复合突变可能带来的发育或复杂表型干扰，使得观察到的表型更直接归因于过表达的人LDLR。
  • 理想对照设置： 该模型允许使用遗传背景完全一致的野生型同窝小鼠作为最严格的对照，极大地提高了实验数据的可比性和可靠性。
  • 应用潜力广泛：
    • LDLR功能与调控机制研究： 为深入探究人LDLR在生理和病理条件下的表达调控、细胞内运输、再循环及其相互作用网络提供了理想平台。
    • 降脂药物作用机制与疗效评估： 该模型是评价作用于LDLR途径的新型药物（如PCSK9抑制剂、靶向LDLR表达的基因疗法或小分子药物）体内药效的关键临床前模型，能更准确地预测其在人体中的效果。
    • 基因治疗载体评估： 可作为评估靶向肝脏递送LDLR基因治疗载体的体内表达效率、持续时间和安全性的重要工具。
    • 高脂血症及动脉粥样硬化研究： 结合高脂饮食或其他诱发因素，可用于研究人LDLR过表达对血脂代谢、血管内皮功能、炎症反应及动脉粥样斑块形成的保护机制。
 

结论
本研究利用CRISPR/Cas9技术与Hipp11安全港位点相结合，成功建立了稳定、高效、特异性过表达功能性人源LDLR的遗传工程小鼠品系。该模型显著克服了传统模型的局限性，人源LDLR的表达水平高、稳定性好、组织分布特异。功能验证证实其能有效降低血浆胆固醇水平并抵抗饮食诱导的高脂血症。此模型的建立为深入研究人LDLR的生物学功能、相关脂质代谢紊乱疾病的病理生理机制以及开发新型降脂药物和基因疗法提供了强大且可靠的研究工具，具有重要的科学价值和广阔的应用前景。

致谢
（此处可添加对资助机构、提供核心试剂或技术支持的研究所/核心设施、实验动物中心工作人员等的感谢，注意避免提及具体商业公司名称）

参考文献

  1. Tasic B, et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. PNAS. 2011.
  2. Hippenmeyer S, et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 2010. (注：此文献报道了Hipp11位点)
  3. Brown MS, Goldstein JL. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 1986. (诺贝尔奖经典综述)
  4. Ishibashi S, et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 1993.
  5. Wang X, et al. Using CRISPR/Cas9 to model human liver disease. JHEP Reports. 2019. (讨论安全港位点应用)
  6. [添加CRISPR构建方法学、LDLR功能检测、血脂测定等相关核心方法文献]
 

(附：关键数据示意图概念图)

  • 图1：靶向策略示意图。 显示Hipp11位点位置、sgRNA切割位点、靶向载体结构（含同源臂、启动子、人LDLR cDNA、pA信号、筛选标记及两侧loxP位点）及同源重组后理想插入结构。
  • 图2：基因型鉴定结果。 (A) 鉴定阳性F0/F1/F2小鼠的PCR凝胶电泳图。(B) Southern Blotting结果图，显示单一条带，证实单拷贝精确整合。
  • 图3：人源LDLR表达分析。 (A) qPCR显示转基因小鼠肝脏中人LDLR mRNA显著高表达。(B) Western Blot显示转基因小鼠肝脏中人源LDLR蛋白强阳性条带（预期分子量附近），野生型无。(C) 肝脏免疫组化，显示人LDLR蛋白（棕色）主要定位于转基因小鼠肝细胞膜。
  • 图4：功能验证结果。 (A) LDL清除试验曲线，显示转基因小鼠清除速率更快。(B) 基础状态下及高脂饮食喂养后，转基因小鼠血浆总胆固醇(TCHO)、LDL-C(LDL-C)水平显著低于同窝野生型(WT)对照小鼠。(图表：Mean ± SEM, *p<0.001)。
 

伦理声明： 本研究涉及的所有动物实验操作均严格遵循国际实验动物评估和认可管理委员会指南，并获得本机构动物实验伦理委员会的审查批准。

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