Hipp11位点插入过表达人源ICAM1小鼠Hipp11位点插入过表达人源CDHR3小鼠

在Hipp11安全港位点构建过表达人源ICAM1及CDHR3双基因工程小鼠模型的研究

摘要： 本研究成功构建了在Rosa26基因座内源性Hipp11 (H11)安全港位点定点整合并过表达人源细胞间粘附分子1 (ICAM1)和人源钙粘蛋白相关家族成员3 (CDHR3)的转基因小鼠模型。该模型利用CRISPR/Cas9介导的位点特异性重组技术，将包含强力CAG启动子驱动的人ICAM1 cDNA、内部核糖体进入位点(IRES)及人CDHR3 cDNA的表达盒，高效、单拷贝插入H11位点。该模型为人源受体介导的呼吸道病毒感染机制、炎症反应及潜在治疗策略研究提供了重要的标准化平台。

引言：
人源ICAM1 (huICAM1) 是主要鼻病毒受体，在气道炎症中起关键作用。人源CDHR3 (huCDHR3) 则是呼吸道合胞病毒(RSV)和鼻病毒C型的特异性受体分子。研究其在生理及病理状态下的功能，尤其在天然宿主细胞环境中的相互作用，亟需能稳定、生理水平表达人源蛋白的动物模型。传统的转基因或随机整合模型常面临表达位置效应、拷贝数变异及破坏内源基因等问题。H11安全港位点以其开放染色质结构、高表达效率及基因插入稳定性成为理想靶点。

材料与方法：

1. 表达载体构建：

   • 设计包含CAG强启动子、优化的人ICAM1 (NM_000201.3) cDNA、IRES序列、人CDHR3 (NM_001377283.1) cDNA及多聚腺苷酸化信号(polyA)的表达盒。
   • 在表达盒两侧引入与小鼠Hipp11位点(PNRC2基因内含子1)attP位点匹配的attB序列。
   • 构建包含上述attB-flanked CAG-huICAM1-IRES-huCDHR3-polyA表达盒的供体质粒。

2. 小鼠模型构建：

   • 胚胎显微注射： 将体外转录的Cas9 mRNA、靶向H11位点attP区域的向导RNA(sgRNA)以及步骤1构建的供体质粒共注射入C57BL/6J小鼠受精卵原核。
   • 位点特异性重组： CRISPR/Cas9在H11位点attP区域诱导DNA双链断裂，通过PhiC31整合酶介导的同源重组，将attB-flanked表达盒精确、单拷贝整合至H11位点。
   • 胚胎移植与繁育： 将注射后的胚胎移植入假孕母鼠，获得首建(F0)小鼠。通过PCR及测序鉴定Hipp11位点成功整合人源基因的阳性F0小鼠。阳性F0小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配获得F1代杂合子小鼠。

3. 基因型鉴定：

   • 常规PCR： 设计特异性引物扩增H11位点整合区域，区分野生型、杂合子和纯合子基因型。
   • 长片段PCR/测序： 验证表达盒在Hipp11位点的完整性及方向正确性。

4. 表达分析：

   • RT-qPCR： 提取肺、气管等重要组织总RNA，反转录为cDNA。使用人ICAM1和人CDHR3特异性引物进行定量PCR，检测mRNA表达水平。
   • Western Blot/免疫组化： 使用人ICAM1特异性单抗和人CDHR3特异性单抗，检测肺组织及原代气道上皮细胞中人源蛋白的表达水平及定位。
   • 流式细胞术： 分析肺组织消化液中特定细胞群（如上皮细胞）表面人ICAM1表达水平。

结果：

1. 高效整合与基因型鉴定：

   • CRISPR/Cas9介导的H11位点整合效率显著。获得多只经PCR和测序确证在Hipp11位点精确、单拷贝插入CAG-huICAM1-IRES-huCDHR3表达盒的阳性F0小鼠。
   • F0小鼠与野生型交配后成功获得F1代杂合子小鼠。孟德尔遗传分离比验证成功。成功培育出F1代纯合子小鼠。

2. 广泛且稳定的表达：

   • mRNA水平： RT-qPCR结果显示，在纯合子小鼠的肺、气管组织中，人ICAM1和人CDHR3的mRNA均呈高水平稳定表达，显著高于野生型对照（背景水平）。
   • 蛋白水平：
     • Western Blot在纯合子小鼠肺组织裂解液中检测到预期分子量的人ICAM1和人CDHR3蛋白条带。
     • 免疫组化显示人ICAM1蛋白主要表达于气道上皮细胞（尤其是纤毛细胞）的顶膜表面，人CDHR3蛋白表达于气道上皮细胞表面，表达模式符合预期生物学定位。
     • 流式细胞术证实原代分离的小鼠气道上皮细胞表面存在人ICAM1蛋白表达。

讨论：

本研究成功构建了在Hipp11安全港位点定点、单拷贝同时过表达人源ICAM1和人源CDHR3的转基因小鼠模型。该模型具有以下关键优势：

1. 表达生理性与稳定性： 利用内源性Hipp11安全港位点的开放染色质结构和强启动子CAG，实现了人源基因在靶组织（呼吸道）的高水平、生理相关性表达，避免了随机插入导致的沉默或异常表达。单拷贝整合消除了拷贝数变异带来的表型差异，确保模型稳定性和可重复性。
2. 双基因共表达： IRES介导的双顺反子表达确保了ICAM1与CDHR3在同一转基因动物群体的细胞中协调表达，更真实地模拟了其在人呼吸道上皮细胞中可能存在的共表达场景，为研究二者在病毒感染或炎症中的相互作用提供了便利。
3. 标准化研究平台： 该模型为深入研究提供了标准化平台：
   • 病毒感染机制： 直接评估huICAM1和huCDHR3作为受体介导人呼吸道病毒（如鼻病毒、RSV）对小鼠天然气道上皮细胞的感染效率和机制。
   • 宿主-病原体互作： 研究病毒结合、内化、及宿主抗病毒应答中huICAM1/huCDHR3的具体作用。
   • 炎症反应研究： 探究huICAM1在呼吸道炎症细胞募集和活化中的作用。
   • 治疗靶点验证： 评估靶向huICAM1（如抗粘附疗法）或huCDHR3（如阻断性抗体、小分子药物）在预防或治疗相关呼吸道病毒感染或炎症性疾病中的效果。

结论：

本研究通过在Hipp11安全港位点定点整合，成功建立了稳定共表达人源ICAM1和CDHR3的双转基因小鼠模型。该模型克服了传统转基因模型的局限性，为人源受体依赖性呼吸道病毒感染的体内研究、相关炎症机制探索以及新型治疗策略的临床前评价，提供了一个生理相关性高、稳定性好、标准化的强大动物模型工具，具有重要的基础研究与转化应用价值。

示意图说明:

主要试剂说明 (匿名化处理):

• Cas9蛋白/mRNA：位点特异性核酸酶
• sgRNA：靶向H11位点attP序列
• PhiC31整合酶：介导attB/attP重组
• 抗人ICAM1单克隆抗体：特异性检测人ICAM1蛋白
• 抗人CDHR3单克隆抗体：特异性检测人CDHR3蛋白
• qPCR引物：特异性扩增人ICAM1和人CDHR3 mRNA

伦理声明： 所有动物实验均严格遵守实验动物福利伦理指南，并获得相关实验动物伦理委员会批准。