多重标记定量蛋白质组学：TMT、iTRAQ与Multinotch技术解析
在生命科学研究中，精确量化复杂生物样本中蛋白质表达水平的变化至关重要。多重标记定量蛋白质组学技术（如TMT、iTRAQ及其衍生技术Multinotch）通过使用化学同位素标签对多组样本进行同时标记和定量分析，显著提高了通量、减少了实验误差，已成为大规模蛋白质组比较研究的核心工具。
一、 技术核心原理
这些技术的核心在于使用一组结构相同但质量不同的化学标签。每个标签都由几个关键部分组成：
- 反应基团： 特异性地与肽段N端氨基及赖氨酸侧链氨基共价结合。
- 报告离子基团： 在质谱碎裂过程中释放出低分子量的离子，其质荷比（m/z）在标签间各不相同，用于定量。
- 质量平衡基团： 确保同一组标签标记的肽段在一级质谱（MS1）中具有相同的总质量，使其在色谱分离时共洗脱。
- 连接基团： 连接报告离子和质量平衡基团。
工作流程：
- 样本制备与酶解： 不同来源的蛋白质样本（如对照组vs疾病组、不同时间点、不同处理组等）分别提取，并用胰蛋白酶等酶解成肽段混合物。
- 化学标记： 每组肽段混合物分别与特定的、具有唯一质量报告离子的标签进行反应。标记后，所有样本的肽段都带有相应的标签。
- 样本混合： 将所有标记好的肽段样本按等量比例混合。此时，相同肽段的不同样本版本（即“同源肽段”）因带有不同的标签而具有不同的报告离子质量，但在一级质谱中共洗脱。
- 液相色谱分离： 混合肽段通过高效液相色谱（HPLC）进行分离，按肽段的理化性质（如疏水性）依次洗脱进入质谱仪。
- 质谱分析：
- MS1扫描： 检测共洗脱肽段母离子的质荷比和强度。同源肽段因其总质量相同（标签的质量平衡基团补偿了报告离子的质量差）而表现为单一色谱峰。
- MS2扫描（碎裂）： 选择MS1检测到的特定肽段母离子进行碎裂。碎裂方式通常选择碰撞诱导解离（CID）或高能碰撞解离（HCD）。在此过程中，报告离子基团被释放出来，产生低m/z的报告离子信号。
- (可选) MS3扫描 (Multinotch核心)： 这是Multinotch技术解决“共洗脱干扰”问题的关键。在MS2扫描中，除了报告离子，肽段骨架也会断裂产生碎片离子（b/y离子）。Multinotch方法在MS2扫描时，利用特殊的碎裂方法（如同步母离子选择SPS）或能量设置，选择性地不碎裂（“notch out”）报告离子区域，而主要碎裂肽段骨架。然后，从MS2产生的多个肽段碎片离子（通常是多个b/y离子）中再选择一个或多个母离子进行MS3扫描。在MS3扫描中，这些被选中的碎片离子进一步碎裂，最终释放出报告离子。由于在MS3阶段选择的母离子已经是经过肽段骨架碎裂产生的、更特异的碎片离子，其来源更单一，受共洗脱肽段干扰的可能性大大降低，因此MS3报告离子的定量结果更准确。
- 定量分析： 在MS2或MS3质谱图中，检测并比较不同报告离子的强度。每种报告离子的强度代表了其对应原始样本中该肽段的相对丰度。通过计算不同报告离子强度的比值，即可获得同一肽段在不同样本间的相对表达量变化。
- 定性分析： 利用MS2或MS3扫描产生的肽段碎片离子谱图（b/y离子）进行数据库检索，鉴定出该肽段对应的蛋白质。
二、 技术优势
- 高通量并行分析： 单次实验可同时比较最多达16组或更多样本（取决于标签组的设计），极大地提高了实验效率，减少了批次效应。
- 减少技术误差： 所有样本在标记后即混合，后续的色谱分离、质谱检测等步骤对所有样本完全一致，最大程度地减少了实验操作引入的变异。
- 高准确性： 同源肽段在MS1中共洗脱，保证了它们在色谱保留时间、离子化效率等方面的高度一致性，其定量比较基于同一MS1峰下释放的报告离子强度。Multinotch (MS3) 进一步提升了定量的准确性。
- 高灵敏度： 现代高分辨率、高灵敏度质谱仪能够有效检测和区分低丰度肽段的报告离子信号。
- 广泛适用性： 适用于各种类型的生物样本（细胞、组织、体液等）和比较研究设计（如时间序列、剂量效应、多因素交互等）。
三、 应用场景
- 差异表达蛋白质组学： 发现疾病（如癌症、神经退行性疾病）生物标志物，研究药物处理、基因敲除/过表达、环境胁迫等引起的蛋白质表达变化。
- 蛋白质互作研究： 结合免疫共沉淀（Co-IP）或亲和纯化质谱（AP-MS），定量分析蛋白质复合物的组成及动态变化（如定量AP-MS, q-AP-MS）。
- 翻译后修饰（PTM）定量： 结合富集技术（如磷酸化肽段富集、乙酰化肽段富集等），精确定量不同条件下特定PTM位点的修饰程度变化。
- 跨物种或跨组织比较： 研究进化、发育或不同器官/细胞类型间的蛋白质组差异。
- 临床队列研究： 在严格标准化的流程下，分析较大规模临床样本（如不同分期的肿瘤组织、不同预后的患者血清/血浆），寻找与疾病诊断、分型、预后相关的蛋白质特征谱。
四、 技术挑战与注意事项
- 标记效率与偏差： 标记反应效率并非100%，且不同肽段或不同样本间可能存在细微差异。通常通过设置内标（如将所有样本等量混合后作为一个“参考”样本）和使用特定算法进行归一化来校正。
- 共洗脱干扰 (Isobaric Interference)： 在MS2定量中，共洗脱的、具有相似母离子质量的无关肽段在碎裂时释放的背景离子可能渗入报告离子通道，导致定量结果偏离真实值。这是该技术最主要的挑战之一。Multinotch (MS3) 是专门为解决此问题而发展的重要改进技术。
- 动态范围限制： 高丰度蛋白质肽段的强信号可能抑制低丰度肽段的检测和定量。
- 样本复杂性： 样本混合后总肽段复杂度极高，对色谱分离和质谱扫描速度/深度提出更高要求。有效的分级分离（如高pH反相色谱分级）常被用来降低复杂度。
- 数据分析复杂性： 数据处理流程复杂，涉及原始数据转换、谱图鉴定、报告离子提取、定量比值计算、归一化、统计学分析、生物信息学注释等多个步骤，需要专业的生物信息学分析。
- 成本： 试剂（标签）和仪器机时成本相对较高，但随着通量提升和普及，单位样本成本在下降。
五、 总结与展望
多重标记定量蛋白质组学技术（TMT/iTRAQ/Multinotch）通过创新的化学标记策略和高性能质谱平台，实现了对复杂生物样本中蛋白质表达的高通量、高精度平行比较。尽管存在共洗脱干扰等挑战，但通过技术优化（如Multinotch MS3）和数据分析方法的进步，其定量准确性和可靠性不断提升。
未来，该技术将继续与样品制备自动化、超高分辨率和高灵敏度质谱仪、更强大的生物信息学工具以及单细胞蛋白质组学、空间蛋白质组学等新兴领域深度结合。其在精准医学（如发现和验证疾病生物标志物、药物靶点）、基础生物学机制研究（如信号通路动态、蛋白质复合物组装）等方面将发挥越来越重要的作用，为深入理解生命过程和疾病机制提供强大的蛋白质层面动态信息。研究人员需要根据具体实验设计（样本数量、样本类型、研究目标、预算等）和对定量准确性的要求（是否必需MS3）来选择最合适的标记方案和技术平台。