人肝癌SMMC-7721绿色荧光标记细胞BALB/c裸小鼠肿瘤模型的构建与应用
摘要： 本研究成功构建了基于绿色荧光蛋白（GFP）标记的人肝癌SMMC-7721细胞的裸小鼠皮下移植瘤模型。该模型稳定可靠，利用活体荧光成像技术可实现肿瘤生长的无创、动态监测，为肝癌体内研究提供了重要的可视化工具。
关键词： SMMC-7721细胞；绿色荧光蛋白（GFP）；裸小鼠；肿瘤模型；活体成像；肝癌
1. 引言
肝癌是全球范围内高发病率与高死亡率的恶性肿瘤之一。建立稳定可靠的体内肿瘤模型是研究肝癌发生发展机制、探索新型治疗策略的关键基础。人肝癌SMMC-7721细胞系是肝癌研究中常用的细胞模型之一。利用绿色荧光蛋白（GFP）对其进行稳定标记，结合免疫缺陷的BALB/c裸小鼠构建皮下移植瘤模型，能够直观、实时地监测肿瘤在活体内的生长、转移以及对治疗的反应，显著提升研究的效率和精度。
2. 材料与方法
- 2.1 主要试剂与仪器：
- 人肝癌SMMC-7721细胞系
- 表达绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体系统
- 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青链霉素混合液
- 聚凝胺（Polybrene）
- 嘌呤霉素（Puromycin）或其他选择性抗生素
- 磷酸盐缓冲液（PBS）
- 细胞冻存液
- 胰蛋白酶-EDTA消化液
- 0.4%台盼蓝溶液
- 医用酒精、碘伏
- 无菌手术器械（镊子、剪刀）
- 1ml无菌注射器及针头
- IVIS Spectrum或类似小动物活体荧光成像系统
- 荧光显微镜及配套软件
- 细胞培养箱、超净工作台、离心机、细胞计数仪
- 小动物饲养设施（SPF级）
- 2.2 实验动物：
- 雌性BALB/c裸小鼠（nu/nu），4-6周龄，体重18-22g。
- 饲养于SPF级环境中，自由摄食饮水，12小时昼夜循环。所有动物实验操作均严格遵守实验动物福利伦理规范，并获得相关伦理委员会批准（请在此处填写实际伦理审批编号）。
- 2.3 实验方法：
- 2.3.1 SMMC-7721细胞的培养与传代：
细胞在含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。每2-3天换液一次，达80-90%融合度时使用胰蛋白酶-EDTA消化传代。 - 2.3.2 GFP慢病毒载体转导SMMC-7721细胞：
- 在感染前一天，将处于对数生长期的SMMC-7721细胞接种于培养板中。
- 感染当天，更换为含适量聚凝胺（如6-8 μg/ml）的新鲜培养基。
- 加入适当滴度（需预实验确定，通常MOI=5-20）的GFP慢病毒上清液。
- 37°C培养箱中孵育8-12小时（或根据病毒说明书推荐时间）。
- 更换为新鲜完全培养基继续培养。
- 2.3.3 稳转GFP阳性细胞株（SMMC-7721-GFP）的筛选与建立：
- 转导48-72小时后，开始加入筛选抗生素（如嘌呤霉素，浓度需通过预实验确定致死浓度）。
- 持续筛选约7-14天，直至未转导的对照组细胞全部死亡。
- 通过有限稀释法或流式分选技术（FACS）挑选发出强且稳定绿色荧光的单克隆细胞进行扩大培养。
- 利用荧光显微镜定期观察并拍照记录荧光表达情况。冻存备用。
- 2.3.4 SMMC-7721-GFP细胞悬液制备：
- 取对数生长期的SMMC-7721-GFP细胞，胰蛋白酶消化后，用完全培养基终止消化。
- 离心（1000 rpm, 5 min）收集细胞，PBS洗涤2次。
- 用无菌PBS或无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至所需密度（通常为5 × 10^6 至 1 × 10^7 个细胞/ml）。
- 0.4%台盼蓝染色检测细胞活力（需>95%）。
- 2.3.5 BALB/c裸小鼠皮下荷瘤：
- 将裸小鼠用1%戊巴比妥钠溶液（0.005-0.01 ml/g体重）腹腔注射麻醉。背部皮肤用医用酒精和碘伏消毒。
- 用1ml注射器吸取适量细胞悬液（如0.1 ml含5 × 10^5 至 1 × 10^6 个细胞），于裸小鼠右侧肩胛区或背部皮下进针注射。
- 注射后缓慢退针，轻压注射部位片刻防止悬液漏出。
- 将小鼠放回笼中，密切观察至苏醒。
- 2.3.6 肿瘤生长监测与活体荧光成像：
- 接种后约5-7天开始，定期（如每周2-3次）观察小鼠状态并用游标卡尺测量肿瘤体积（V = 长径 × 短径² × 0.5）。
- 利用小动物活体荧光成像系统定期进行无创监测：
- 小鼠经麻醉（常用异氟烷吸入麻醉）后放入成像暗箱。
- 设置激发滤光片（通常为465-490 nm）和发射滤光片（通常为515-575 nm）以捕捉GFP信号。
- 设置适当的曝光时间（避免信号饱和），采集荧光图像及叠加的伪彩图。
- 利用成像系统自带软件分析荧光强度（通常以光子通量表示），作为肿瘤负荷的量化指标。
- 监测过程中保持小鼠体温。
- 当肿瘤体积达到约1500 mm³（或根据实验设定终点），或小鼠出现明显痛苦征象时，以颈椎脱臼法或其他人道方式处死小鼠，完整剥离肿瘤组织。
- 2.3.7 离体验证：
- 剥离的肿瘤组织一部分置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片，进行HE染色观察组织病理学特征。
- 另一部分可制成冰冻切片或组织匀浆，直接在荧光显微镜下观察GFP荧光表达情况或进行流式细胞术分析GFP阳性细胞比例。
- 可留取部分组织样本用于后续分子生物学或生化分析。
- 2.3.1 SMMC-7721细胞的培养与传代：
3. 结果
- 3.1 SMMC-7721-GFP稳转细胞株的建立： 经过慢病毒转导和抗生素筛选，成功获得稳定高表达GFP的SMMC-7721细胞株（SMMC-7721-GFP）。在荧光显微镜下（200×以上放大倍率）可见清晰的绿色荧光，主要定位于细胞质内（图1A）。流式细胞术检测显示GFP阳性率通常>95%。
- 3.2 裸小鼠皮下移植瘤模型的建立： SMMC-7721-GFP细胞在BALB/c裸小鼠皮下接种后，成瘤率通常可达90-100%。接种后约7-10天可触及小结节，约14天后荧光成像系统可清晰检测到肿瘤部位的绿色荧光信号（图1B）。
- 3.3 肿瘤生长与荧光成像监测： 肿瘤在裸小鼠体内呈稳定的指数增长。活体荧光成像显示，随着时间推移，肿瘤部位的荧光信号强度持续显著增强（图1C），其变化趋势与肿瘤体积的测量结果高度一致（图2）。荧光信号强度可作为肿瘤负荷的可靠定量指标。
- 3.4 离体组织学与荧光验证：
- HE染色： 肿瘤组织切片HE染色显示典型的肝癌细胞形态学特征，如细胞异型性大，核质比例高，可见核分裂象，排列成巢状或条索状，符合人肝癌移植瘤的病理特点（图3A）。
- 荧光显微镜观察： 肿瘤组织冰冻切片或新鲜组织压片在荧光显微镜下可观察到大量发出明亮绿色荧光的肿瘤细胞（图3B），证实了荧光标记在体内环境中的稳定性。
- 瘤体荧光成像： 剥离的完整瘤体在成像系统中呈现强烈的绿色荧光信号（图3C）。
4. 讨论
本研究成功构建了基于GFP标记的人肝癌SMMC-7721细胞的BALB/c裸小鼠皮下移植瘤模型。该模型的关键优势在于：
- 可视化与定量化： GFP标记使得利用活体成像技术无创、实时、动态地监测体内肿瘤的生长成为可能，克服了传统卡尺测量在肿瘤微小或形态不规则时的不准确性，并能提供肿瘤负荷的定量数据（荧光强度）。
- 高特异性和稳定性： GFP作为内源性报告基因，无需外源性底物，背景干扰低，荧光信号特异指向肿瘤细胞，且在体内能稳定表达较长时间（需注意长期实验可能存在轻微荧光衰减）。
- 模型稳定性与重复性好： SMMC-7721细胞在BALB/c裸小鼠中成瘤率高，生长速度适中且相对一致，有利于实验结果的可靠性。
- 应用广泛：
- 肿瘤生物学研究： 研究肝癌细胞的体内增殖、凋亡、侵袭转移潜能。
- 抗肿瘤药物评价： 直观快速地评估候选药物（化疗药、靶向药、免疫疗法、中药单体/复方等）在体内的抑瘤效果（通过监测荧光信号强度变化和肿瘤体积缩小），研究药物作用机制（如诱导凋亡、抑制血管生成对荧光分布的影响）。
- 肿瘤转移研究： 可用于建立自发或实验性转移模型，追踪循环肿瘤细胞（CTC）和微小转移灶（灵敏度优于肉眼或普通显微镜）。
- 分子影像探针验证： 作为阳性对照，验证新型肿瘤靶向分子影像探针的特异性和有效性。
- 肿瘤微环境研究： 结合其他标记（如标记基质细胞、血管），研究肿瘤细胞与微环境的相互作用。
需要指出的一些注意事项：
- 荧光衰减： 长期实验（>6-8周）需关注GFP荧光信号可能的自然衰减趋势。
- 自发荧光干扰： 小鼠食物（如含叶绿素饲料）、某些药物或组织（如毛发、皮肤角质层）可能产生非特异性自发荧光，需通过优化成像参数和使用特异性滤光片加以区分。
- 成像深度限制： 活体成像对深部组织（如腹腔、颅腔）的小病灶灵敏度较低，更适合皮下或浅表组织肿瘤监测。
- 免疫缺陷背景： 裸小鼠缺乏功能性T细胞，其肿瘤微环境与具有完整免疫系统的宿主存在差异，在涉及免疫机制的研究中需谨慎解读结果。
5. 结论
GFP标记的人肝癌SMMC-7721细胞在BALB/c裸小鼠体内成功建立了可视化皮下移植瘤模型。该模型操作相对简便，成瘤率高，生长稳定，通过活体荧光成像技术实现了对肿瘤生长的无创、动态、定量化监测。该模型是研究肝癌体内生物学行为、筛选和评估抗肝癌药物以及探索肝癌转移机制的有力工具，具有重要的应用价值。未来可进一步利用该模型探索肝癌发生发展的分子机制及新的治疗靶点。
图注：
- 图1： (A) SMMC-7721-GFP细胞在荧光显微镜下的明场与荧光叠加图（标尺=100μm）。(B) 接种SMMC-7721-GFP细胞14天后荷瘤裸小鼠的活体荧光成像图（叠加伪彩）。(C) 不同时间点（如第14、21、28天）荷瘤裸小鼠的活体荧光成像图（叠加伪彩）。
- 图2： 肿瘤体积（左纵轴，mm³）和肿瘤部位平均荧光强度（右纵轴，光子通量/秒）随时间（横轴，天）的变化曲线图（显示两者高度正相关）。
- 图3： (A) 移植瘤组织HE染色切片（标尺=50μm）。(B) 移植瘤组织冰冻切片在荧光显微镜下的荧光图（标尺=100μm）。(C) 剥离的完整移植瘤在成像系统中的明场照片及对应的荧光成像叠加伪彩图。
参考文献：
（此处省略参考文献列表，实际撰写时应引用相关细胞系特性、慢病毒/GFP标记技术、裸小鼠模型应用、活体成像技术及肝癌研究的关键文献）
