人肝癌SMMC-7721红色荧光标记细胞BALB/c裸小鼠肿瘤模型

人肝癌SMMC-7721红色荧光标记细胞BALB/c裸小鼠肿瘤模型的建立与应用

本研究成功构建了稳定表达红色荧光蛋白tdTomato的人肝癌SMMC-7721细胞株，并在BALB/c裸小鼠体内建立了可实时、原位监测的皮下移植瘤模型。该模型为肝癌生长、转移机制研究及抗肿瘤药物体内评价提供了重要的可视化工具。

第一部分：稳定表达tdTomato的SMMC-7721细胞株构建

1. 细胞培养：

   • 人肝癌细胞株SMMC-7721于含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)的DMEM高糖培养基中培养。
   • 培养环境：37°C, 5% CO2, 饱和湿度。
   • 常规胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

2. 慢病毒载体包装与转导：

   • 采用携带tdTomato红色荧光蛋白基因及嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体系统。
   • 在293T细胞中进行慢病毒包装，收集病毒上清液并测定滴度。
   • SMMC-7721细胞接种于6孔板，待融合度达30-40%时，加入适量病毒上清液及聚凝胺（增强感染效率），37°C孵育。
   • 24小时后更换新鲜完全培养基。

3. 稳定转染细胞株筛选：

   • 转导48小时后，加入含嘌呤霉素（工作浓度需预实验确定）的完全培养基进行加压筛选。
   • 每2-3天更换含药新鲜培养基，持续筛选10-14天。
   • 挑取存活的单克隆或混合克隆，扩大培养。

4. 荧光表达鉴定：

   • 荧光显微镜观察： 在倒置荧光显微镜下观察细胞，确认tdTomato红色荧光在细胞质中的广泛、均匀且明亮表达。
   • 流式细胞术分析： 收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤重悬，使用流式细胞仪检测tdTomato阳性细胞比例，筛选荧光表达率高（>95%）且稳定的细胞群（命名为SMMC-7721-tdTomato）。
   • 细胞增殖能力验证： 通过CCK-8或细胞计数法比较SMMC-7721-tdTomato与亲本细胞的增殖曲线，确保荧光标记未显著改变细胞体外增殖特性。

第二部分：BALB/c裸小鼠皮下移植瘤模型的建立

1. 实验动物准备：

   • 选用4-6周龄雌性BALB/c裸小鼠。
   • 饲养于无特定病原体级屏障环境，温度(22±2°C)，湿度(50±10%)，12/12小时明暗循环。提供无菌饲料和饮用水。
   • 实验方案经相关机构实验动物伦理委员会审查批准。

2. 细胞悬液制备：

   • 收集对数生长期的SMMC-7721-tdTomato细胞，用胰酶消化，磷酸盐缓冲液洗涤两次。
   • 用无菌无血清培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至规定浓度（如1 × 10^7 cells/mL）。置于冰上备用。

3. 皮下接种：

   • 小鼠腹腔注射合适剂量的麻醉剂进行麻醉。
   • 酒精消毒小鼠右侧腋下或背部皮肤。
   • 使用1 mL注射器吸取100 μL细胞悬液（含1 × 10^6个细胞），皮下注射接种。
   • 轻轻按压注射部位，防止细胞悬液漏出。

4. 术后护理：

   • 将小鼠放回笼内，置于温暖环境直至完全苏醒。
   • 常规饲养观察。

第三部分：肿瘤生长与荧光监测

1. 肿瘤外观观察与体积测量：

   • 接种后定期（如每2-3天）观察小鼠状态及接种部位。
   • 使用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)。
   • 按公式计算肿瘤体积(V)：V = (a × b²) / 2 (单位：mm³)。
   • 绘制肿瘤生长曲线。

2. 活体荧光成像监测：

   • 使用小动物活体荧光成像系统进行监测。
   • 成像前，小鼠腹腔注射麻醉剂进行麻醉。
   • 将小鼠置于成像腔中，拍摄明场照片。
   • 选择适用于tdTomato的激发/发射滤光片组合（通常激发波长~554 nm，发射波长~581 nm）。
   • 调整曝光时间、光圈等参数，确保获得清晰荧光信号且不饱和。
   • 获取荧光图像，并与明场图像叠加。
   • 利用成像系统配套软件定量分析肿瘤区域的荧光强度（平均光子通量或总光子通量）。
   • 定期（如每周1-2次）进行活体成像，记录肿瘤荧光信号随时间的动态变化。

3. 终点取材与离体验证：

   • 当肿瘤体积达到预设终点（如1000-1500 mm³）或动物出现明显痛苦征兆时，实施安乐死。
   • 完整剥离肿瘤组织。
   • 离体荧光成像： 立即使用小动物活体成像系统对离体肿瘤进行荧光成像，验证体内成像结果。
   • 组织处理： 肿瘤组织分为三部分：
     • 一部分冻存于液氮或-80°C，用于后续分子生物学分析。
     • 一部分固定于中性福尔马林溶液中，用于石蜡包埋切片。
     • 一部分用于制作冰冻切片。

第四部分：模型验证

1. 组织学分析：

   • 石蜡切片进行苏木精-伊红染色，确认肿瘤组织为典型的肝癌病理形态。
   • 石蜡切片或冰冻切片直接在荧光显微镜下观察肿瘤组织中tdTomato红色荧光蛋白的表达情况，验证荧光信号来源于肿瘤细胞本身。

2. 荧光强度与肿瘤体积相关性分析：

   • 统计不同时间点测得的肿瘤体积与对应的活体成像荧光强度数据。
   • 进行相关性分析（如Pearson或Spearman相关），通常可见荧光强度与肿瘤体积呈显著正相关，证明活体荧光成像是监测肿瘤生长的可靠手段。

第五部分：模型特点与应用

• 可视化优势： 肿瘤细胞稳定表达明亮的红色荧光蛋白tdTomato，可通过非侵入性的活体荧光成像技术实时、动态、原位监测肿瘤的生长、位置和大小变化，灵敏度高。
• 适用性： BALB/c裸小鼠缺乏功能性T细胞，对异种移植物的排斥反应弱，是建立人源肿瘤异种移植模型的常用动物。
• 应用方向：
  • 肿瘤生物学研究： 深入研究肝癌在体内的生长动力学、侵袭转移过程（若研究转移模型）。
  • 抗肿瘤药物评价：
    • 药效学评价：连续监测药物治疗组与对照组肿瘤荧光信号（反映肿瘤负荷）的变化，直观评估药物抑制肿瘤生长的效果。
    • 药物分布研究：结合荧光标记药物或利用肿瘤自身荧光作为定位参照。
  • 肿瘤靶向治疗研究： 评价靶向药物或载药系统的肿瘤靶向性和富集效果。
  • 肿瘤微环境研究： 结合其他标记物或技术研究肿瘤与宿主微环境的相互作用。

注意事项

• 生物安全： 操作人源细胞株及病毒载体需遵守相关生物安全规定。
• 动物福利： 严格遵守实验动物伦理规范，密切监测动物状态，及时处理肿瘤过大或出现溃疡、坏死等情况的动物。
• 荧光稳定性： 长期传代或体内生长过程中需定期检测细胞或肿瘤组织中tdTomato的表达稳定性。
• 荧光背景： 需注意裸鼠自身可能存在的弱自发荧光（如毛发、食物残渣），设置对照组，优化成像参数以减少背景干扰。
• 深度限制： 活体荧光成像的探测深度有限（通常几毫米），对于深部组织或微小转移灶的探测能力受限。

结论：

本研究成功建立了基于红色荧光蛋白tdTomato标记的人肝癌SMMC-7721细胞的BALB/c裸小鼠皮下移植瘤模型。该模型通过活体荧光成像技术实现了对肿瘤生长的无创、实时、可视化监测，荧光信号强度与肿瘤体积显著正相关。组织学验证证实了肿瘤的肝癌特征和tdTomato蛋白的稳定表达。该模型构建方法可靠，为肝癌的体内研究，特别是抗肿瘤药物的体内药效评价和机制探索，提供了一个强有力的可视化平台。