人肝癌BEL-7402荧光素酶标记细胞BALB/c裸小鼠肿瘤模型的建立与应用
摘要： 本研究成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的人肝癌BEL-7402细胞系 (BEL-7402-luc)，并将其接种于免疫缺陷BALB/c裸小鼠皮下，建立了可在体实时监测肿瘤生长与转移的荧光素酶标记肝癌皮下移植瘤模型。该模型为肝癌体内研究提供了重要的可视化工具。
关键词： 肝癌；BEL-7402细胞；荧光素酶；活体成像；裸小鼠；肿瘤模型
1. 引言
肝癌是全球范围内高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一。建立能够模拟肝癌生物学特性、便于在体动态监测的动物模型，对于深入探究肝癌发生发展机制、评估新型治疗策略（如靶向药物、免疫疗法、基因治疗等）的疗效至关重要。传统的移植瘤模型依赖于定期解剖或卡尺测量肿瘤体积，难以实现无创、实时、动态的监测。利用分子影像技术，特别是基于荧光素酶报告基因的生物发光成像技术，可以克服这一局限。本研究旨在建立基于人肝癌BEL-7402细胞系、稳定表达荧光素酶的BALB/c裸小鼠皮下移植瘤模型。
2. 材料与方法
2.1 细胞系与培养
- 细胞系： 人肝癌细胞系BEL-7402。
- 培养条件： 细胞常规培养于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。隔天更换培养基，待细胞生长至80%-90%融合度时，使用胰蛋白酶-EDTA溶液消化传代。
2.2 荧光素酶稳定表达细胞株的构建
- 病毒转导： 利用携带萤火虫荧光素酶基因 (Firefly Luciferase, Fluc) 的慢病毒载体系统感染对数生长期的BEL-7402细胞。
- 筛选： 感染48小时后，在培养基中加入适宜浓度的嘌呤霉素进行加压筛选，持续约2周，直至未转导的对照细胞全部死亡。
- 单克隆化与扩增： 挑取存活的单克隆细胞，扩大培养，建立稳定表达荧光素酶的细胞株，命名为BEL-7402-luc。
- 体外验证： 在培养皿中加入荧光素酶底物D-荧光素钾盐，立即使用活体成像系统检测细胞发出的生物发光信号强度，验证荧光素酶的表达活性。
2.3 动物与伦理
- 动物： 雌性BALB/c裸小鼠（nu/nu），4-6周龄。
- 饲养条件： 饲养于无特定病原体(SPF)级动物实验室内，独立通风笼具(IVC)系统，自由摄食饮水，恒温(22±2°C)、恒湿(50±10%)，12小时明暗循环。
- 伦理： 所有动物实验操作均严格遵守实验动物福利伦理规范，并获得所在机构动物实验伦理委员会的批准。
2.4 裸小鼠皮下荷瘤模型的建立
- 细胞准备： 取对数生长期的BEL-7402-luc细胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗涤两次，用不含血清的培养基或PBS重悬细胞。
- 细胞计数与调整： 调整细胞密度至5 × 10^6 cells / 100 μL（用于皮下接种）。
- 接种： 使用1mL注射器吸取100 μL细胞悬液，在裸小鼠右侧腋下近前肢部位进行皮下注射。整个过程严格无菌操作。
2.5 肿瘤生长监测
- 宏观测量 (游标卡尺法)：
- 接种后每周测量2-3次肿瘤大小。
- 测量肿瘤长径(a)和短径(b)，按公式计算肿瘤体积 (TV)： TV = (a × b²) / 2。
- 绘制肿瘤生长曲线。
- 活体生物发光成像监测：
- 定期（如每周1-2次）进行活体成像。
- 小鼠腹腔注射D-荧光素钾盐溶液 (150 mg/kg 体重)。
- 注射后10-15分钟，将小鼠麻醉（通常使用异氟烷吸入麻醉），置于成像暗箱中。
- 使用小动物活体光学成像系统采集生物发光信号（曝光时间通常为1秒至几分钟，依信号强弱调整）。
- 使用成像分析软件，在肿瘤发光区域绘制感兴趣区域(ROI)，记录总光通量(Total Flux, photons/s)作为肿瘤发光强度的定量指标。
- 绘制肿瘤生物发光强度变化曲线。
2.6 终点观察与组织样本收集
- 当肿瘤体积达到约1500 mm³ 或小鼠出现明显消瘦、活动障碍等符合伦理终结标准的情况时，处死小鼠（通常采用颈椎脱臼法或二氧化碳吸入法）。
- 完整剥离肿瘤组织，称重，拍照记录。
- 部分肿瘤组织固定于10%中性福尔马林溶液中，用于后续石蜡包埋、切片及苏木素-伊红(HE)染色等组织病理学分析。
- 部分肿瘤组织迅速冷冻于液氮中，储存于-80°C超低温冰箱，用于后续分子生物学检测（如PCR、Western blot验证荧光素酶表达）。
- 怀疑有转移时，仔细解剖主要脏器（如肺、肝、淋巴结等），进行体外生物发光成像或组织病理学检查。
3. 结果
3.1 稳定表达荧光素酶的BEL-7402-luc细胞株建立
- 经嘌呤霉素筛选成功获得稳定表达萤火虫荧光素酶的BEL-7402-luc细胞株。
- 体外加入D-荧光素后，BEL-7402-luc细胞可检测到强烈的生物发光信号，而亲本BEL-7402细胞无信号（图1A）。
- 细胞生长曲线表明，荧光素酶的稳定表达对BEL-7402细胞的体外增殖能力无明显影响（图1B）。
3.2 皮下移植瘤模型建立成功
- BEL-7402-luc细胞接种于BALB/c裸小鼠皮下后，约7-10天可在注射部位触及明显结节。
- 肿瘤接种成功率为100%。
- 肿瘤在裸小鼠皮下呈进行性生长。
3.3 肿瘤生长动态监测
- 常规测量结果： 卡尺测量显示肿瘤体积随时间显著增大（图2A）。
- 活体成像结果：
- 腹腔注射D-荧光素后，可在接种部位清晰检测到局限性的强生物发光信号，信号强度与触诊/卡尺测量的肿瘤大小变化趋势一致（图2B）。
- 连续多次活体成像显示，肿瘤区域的生物发光强度（总光通量）随肿瘤生长而显著增加（图2C），与肿瘤体积测量结果高度相关（图2D）。
- 活体成像技术能够更早地（通常在接种后第3-5天）通过生物发光信号检测到微小瘤灶的形成，早于可触及结节的出现。
3.4 终点分析与组织学验证
- 解剖后剥离的肿瘤组织呈实体瘤块（图3A）。
- 组织病理学 (HE染色)： 肿瘤组织保留了人肝癌BEL-7402细胞的形态学特征，表现为异型性明显的癌细胞巢状或腺样排列，核分裂像易见，符合低分化肝细胞癌的特征（图3B）。
- 体外生物发光成像： 剥离的肿瘤组织在体外加入D-荧光素后仍能发出强烈的生物发光信号（图3C），证明荧光素酶在体内持续稳定表达。
- 分子水平验证： RT-PCR或Western blot检测证实肿瘤组织中存在萤火虫荧光素酶基因mRNA或蛋白的表达（图3D）。
4. 讨论
本研究成功构建了基于人肝癌BEL-7402细胞、稳定表达萤火虫荧光素酶的BALB/c裸小鼠皮下移植瘤模型。该模型的关键优势在于整合了生物发光活体成像技术：
- 可视化与定量化： 荧光素酶催化底物D-荧光素氧化发光的过程依赖于ATP和氧气，因此发光信号强度直接反映活肿瘤细胞的数目和代谢活性，为肿瘤负荷提供了高度灵敏、特异的定量指标。
- 无创、实时、动态监测： 可在同一只小鼠体内反复、无创地对原位肿瘤的生长进行定量监测，避免了传统终点法实验需要牺牲大量动物、个体差异影响大的缺点。大大减少了所需动物数量，符合3R原则（减少、优化、替代）。
- 早期检测敏感性高： 相比触诊或卡尺测量，活体成像能在肿瘤生长的更早期（如接种后数天，肿瘤体积尚微小时）就检出信号，灵敏度显著提高。
- 监测微小转移灶潜能： 该技术理论上具备探测深部器官微小转移灶的能力（尽管受限于组织穿透深度，对深层微小病灶的灵敏度会下降），为研究肝癌的转移提供了有力工具。
- 评估治疗反应灵敏： 发光信号的快速变化能够更早、更灵敏地反映出药物或治疗（如化疗、放疗、靶向、免疫治疗等）对肿瘤细胞的杀伤效果或抑制作用，是评估疗效的理想指标。例如，治疗组肿瘤发光信号的减弱或消失可先于体积的明显缩小被检测到。
- 模型稳定性： BEL-7402细胞在裸小鼠体内成瘤性好，生长相对稳定。荧光素酶基因通过慢病毒载体整合到细胞基因组，保证了其在体内外长时间培养和体内成瘤过程中的稳定表达。组织病理学证实肿瘤保持了亲本细胞的人肝癌特性。
局限性：
- 发光深度限制： 生物发光信号的组织穿透能力有限，尤其对于深部器官（如肝内原位瘤或腹腔深部转移灶）的微小病灶检测存在挑战。表面或浅表肿瘤成像效果最佳。
- 荧光素分布： 底物D-荧光素主要通过腹腔注射或尾静脉注射进入血液循环，其分布代谢可能影响信号强度和均匀性。
- 裸小鼠免疫缺陷： BALB/c裸小鼠缺乏功能性T细胞，免疫系统不健全，不能完全模拟人体免疫微环境对肿瘤的作用，限制了其在免疫治疗研究中的应用。需要使用更复杂的免疫人源化模型补充。
5. 结论
本研究成功建立了稳定表达荧光素酶的人肝癌BEL-7402细胞株BEL-7402-luc及其在BALB/c裸小鼠体内的皮下移植瘤模型。该模型结合活体生物发光成像技术，实现了对皮下肿瘤生长快速、灵敏、无创、定量的实时动态监测。该模型不仅为BEL-7402肝癌细胞的体内生物学行为研究（如增殖、侵袭、转移潜能）提供了可视化平台，更是高通量筛选抗肝癌药物、评估新型治疗策略（包括靶向治疗、基因治疗等）体内疗效及药效动力学的理想工具。其建立方法成熟可靠，可推广应用于其他肿瘤细胞系的标记与模型构建。
（注：文中提及的试剂、仪器等均未包含具体企业品牌信息。）
