红色荧光标记人胰腺癌细胞PANC-1皮下接种裸鼠肿瘤模型

发布时间：2026-04-16 阅读量：10 作者：生物检测中心

红色荧光标记人胰腺癌细胞PANC-1皮下接种裸鼠肿瘤模型的建立与应用

摘要：
本研究构建了稳定表达红色荧光蛋白（RFP）的人胰腺癌细胞株PANC-1，并通过皮下接种于免疫缺陷裸鼠，成功建立了可在体实时观测的胰腺癌移植瘤模型。该模型为胰腺癌生长、转移机制研究及抗肿瘤药物体内评价提供了可视化平台。

一、 引言
胰腺癌恶性程度高，缺乏有效治疗手段。建立可靠且易于监测的动物模型对研究其生物学特性至关重要。红色荧光标记结合裸鼠模型可实现肿瘤生长实时监测，具有直观、无创的优势。

二、 材料与方法

  1. 材料

    • 细胞株： 人胰腺癌细胞系 PANC-1（典型KRAS突变）。
    • 实验动物： BALB/c nu/nu 品系雌性裸鼠（4-6周龄），SPF级环境饲养。
    • 荧光标记： 红色荧光蛋白（RFP）编码基因慢病毒表达载体（如：pLVX-mCherry）。
    • 主要试剂： 细胞培养基（如：DMEM）、胎牛血清、嘌呤霉素筛选液、胰蛋白酶、无菌PBS、基质胶。
    • 主要仪器： 生物安全柜、CO₂培养箱、倒置荧光显微镜、小动物活体成像系统、手术器械。

  2. 方法

    • 细胞培养： PANC-1细胞常规培养于含10%胎牛血清及青霉素/链霉素的培养基中，37°C、5% CO₂培养。
    • 稳定转染与筛选：
      • 利用慢病毒感染PANC-1细胞，携带RFP基因。
      • 感染后48小时，加入含适量浓度的嘌呤霉素筛选液进行加压筛选（通常2-4周）。
      • 通过流式细胞术或荧光显微镜挑选并扩增高表达RFP的阳性单克隆细胞株，命名为PANC-1-RFP。
      • 定期检查荧光表达稳定性（传代10代以上）。
    • 裸鼠肿瘤模型建立：
      • 收集对数生长期PANC-1-RFP细胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗涤重悬。
      • 将细胞悬液与预冷基质胶按1:1体积比混合均匀（终浓度通常为5×10⁶至1×10⁷ cells/mL）。
      • 裸鼠麻醉后，于背部肩胛区或侧腹部皮肤消毒。
      • 使用1mL注射器吸取100μL细胞-基质胶混合液，皮下缓慢注射接种。
      • 记录接种日期及细胞数量。
    • 模型监测：
      • 荧光成像： 接种后定期（如每周2-3次）使用小动物活体成像系统观测裸鼠背部肿瘤部位RFP荧光信号强度及分布。成像前裸鼠麻醉。
      • 肿瘤生长测量： 当肉眼可见或触及肿瘤后（约接种后7-14天），每周2-3次用游标卡尺测量肿瘤长径（L）和短径（W），按公式计算肿瘤体积（V）：V = (L × W²) / 2。
      • 终点判定： 当肿瘤体积达到预设终点（如1000 mm³）或动物出现明显痛苦征象（消瘦、活动减少、肿瘤溃疡等）时，麻醉后处死动物，剥离肿瘤组织。
    • 离体验证：
      • 剥离的肿瘤组织部分进行称重、拍照（白光/荧光）。
      • 部分组织经固定、脱水、石蜡包埋、切片。
      • 进行苏木素-伊红（H&E）染色进行组织学病理分析。
      • 冰冻切片或石蜡切片脱蜡后进行荧光显微镜观察，确认肿瘤内RFP阳性细胞分布。
      • 必要时进行免疫组织化学染色验证胰腺癌标志物表达。
 

三、 结果

  1. 稳定荧光细胞株构建： 成功获得稳定高表达红色荧光的PANC-1-RFP细胞株，体外培养荧光强度高且稳定，在荧光显微镜下清晰可见。
  2. 皮下成瘤： 所有接种PANC-1-RFP细胞的裸鼠均成功成瘤（成瘤率可达100%）。肿瘤起始呈小结节状，随时间推移逐渐增大。
  3. 活体荧光成像： 小动物活体成像系统可清晰检测到皮下肿瘤部位明亮的RFP荧光信号（图1）。荧光信号强度随肿瘤体积增大而增强，呈现良好的线性或指数相关性（图2）。
  4. 肿瘤生长曲线： 肿瘤体积随时间呈指数增长趋势，生长曲线清晰可辨（图3）。
  5. 离体验证：
    • 大体观察： 剥离的肿瘤组织肉眼观察呈红色（部分源于基质胶血管及肿瘤自身血管），在激发光照射下发出明亮红光（图4）。
    • 组织学： H&E染色证实为典型的人胰腺癌组织形态（如腺样结构、核异型性明显、间质丰富）（图5A）。
    • 荧光显微镜： 肿瘤组织切片在荧光显微镜下可见大量RFP阳性癌细胞分布（图5B）。
    • 免疫组化： 肿瘤细胞表达胰腺癌相关标志物（如CK19、CEA等）。
 

四、 讨论

  1. 模型优势：

    • 可视化监测： RFP标记实现肿瘤生长、潜在微小转移灶的非侵入性、实时动态监测，显著优于仅靠卡尺测量。
    • 操作便捷： 皮下接种技术成熟，易于操作，成瘤率高，肿瘤位置表浅便于观察和测量。
    • 背景清晰： RFP激发/发射波长较长，组织穿透性相对优于GFP，自体荧光干扰小。
    • 保留特性： 选用PANC-1细胞株，遗传背景明确（典型KRAS突变），保留了人胰腺癌的侵袭性等关键生物学特性。
    • 应用广泛： 特别适用于抗肿瘤药物疗效评价（如给药后肿瘤生长抑制率、荧光强度变化）、肿瘤生物学行为（增殖、凋亡、血管生成）研究。

  2. 模型局限性：

    • 免疫缺陷环境： 裸鼠缺乏功能性T细胞，无法模拟人体免疫系统与肿瘤的相互作用，限制了在免疫治疗研究中的应用。可考虑使用人源化小鼠模型或其它免疫健全模型作为补充。
    • 基质影响： 基质胶可促进成瘤，但引入了额外成分，可能影响肿瘤微环境。
    • 原位性不足： 皮下模型与胰腺原位微环境存在差异，肿瘤的生长、转移模式可能与临床实际不完全一致。建立原位模型更为复杂。
 

五、 结论
本研究成功建立了稳定表达红色荧光蛋白的PANC-1-RFP细胞株及其裸鼠皮下移植瘤模型。该模型具备成瘤率高、荧光信号稳定、可视化程度好、易于操作和监测等优点，为胰腺癌的体内研究，特别是抗肿瘤药物的药效学评价提供了一种直观可靠的工具。结合后续的组织病理学和分子生物学分析，可深入探究胰腺癌发生发展机制及治疗反应。

参考文献： (此处应列出实际引用的相关方法学及背景文献)

  1. Hollingsworth, M. A., & Swanson, B. J. (2004). Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nature reviews cancer, 4(1), 45-60. (胰腺癌背景)
  2. Hoffman, R. M. (2005). The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer, 5(10), 796-806. (肿瘤荧光成像综述)
  3. Jenkins, D. E., et al. (2003). Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis. Clinical & experimental metastasis, 20(8), 733-744. (活体成像应用)
  4. 具体建立PANC-1裸鼠皮下模型或使用慢病毒载体进行荧光标记的方法学文献。
 

图注：

  • 图1： 裸鼠背部皮下接种PANC-1-RFP细胞后不同时间点（如第7、14、21、28天）的活体荧光成像图。伪彩叠加显示肿瘤区域RFP荧光信号强度从弱到强的动态变化过程。
  • 图2： （左）肿瘤体积（mm³）随时间（天）变化的生长曲线图；（右）肿瘤组织荧光强度（Radiance, p/s/cm²/sr）与肿瘤体积（mm³）之间的相关性散点图及回归线。
  • 图3： 裸鼠背部接种部位皮下肿瘤的生长照片（白光）。展示肿瘤从微小结节到明显肿块的形态演变过程。
  • 图4： 剥离的肿瘤组织在白光（左）和激发光照射下（右）的照片。白光下显示肿块形态，激发光下显示明亮的红色荧光。
  • 图5A： 肿瘤组织H&E染色切片显微照片（如400倍）。显示典型的胰腺导管腺癌腺样结构、细胞异型性及丰富间质。
  • 图5B： 同一肿瘤组织或相邻切片在荧光显微镜下的显微照片（如400倍）。显示大量癌细胞胞浆内明亮的红色荧光信号。
底部图片-PC版 底部图片-移动版