红色荧光标记人胰腺癌细胞SW1990皮下接种裸鼠肿瘤模型

红色荧光标记人胰腺癌细胞SW1990皮下接种裸鼠肿瘤模型的建立与初步评价

摘要：
胰腺导管腺癌恶性程度高，预后极差，亟需有效的体内模型研究其发生发展及干预策略。本研究成功构建了红色荧光标记人胰腺癌细胞SW1990的稳定株，并利用此细胞建立了可在体实时监测的裸鼠皮下移植瘤模型，为胰腺癌研究提供了可视化工具。

一、材料与方法

1. 细胞培养：

   • 人胰腺癌细胞株SW1990于含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中常规培养。
   • 细胞呈贴壁生长，胰蛋白酶消化传代，选取对数生长期细胞进行实验。

2. 红色荧光蛋白标记：

   • 采用携带红色荧光蛋白(RFP，如mCherry或DsRed)基因的慢病毒载体系统进行转导。
   • SW1990细胞接种于培养板，待融合度达40%-60%。加入适当滴度的慢病毒上清及Polybrene(终浓度6-8 μg/mL)，培养过夜。
   • 更换新鲜培养基继续培养48-72小时，在荧光显微镜下观察荧光表达。
   • 加入筛选抗生素(如嘌呤霉素或G418)，筛选获得稳定高表达RFP的单克隆细胞(SW1990-RFP)。
   • 验证：
     • 荧光显微镜下观察标记效率及荧光强度。
     • 流式细胞术分析荧光阳性细胞比例(>95%用于后续实验)。
     • 体外连续传代培养，确认荧光标记的稳定性。
     • 细胞增殖实验(CCK-8法)确认标记过程对SW1990细胞增殖活力无明显影响。

3. 裸鼠皮下移植瘤模型建立：

   • 实验动物： 选用4-6周龄雌性BALB/c裸鼠(无胸腺，T细胞免疫缺陷)，饲养于SPF级动物房，自由饮水进食。
   • 细胞悬液制备： 收集对数生长期SW1990-RFP细胞，胰蛋白酶消化，PBS洗涤两次，用无血清培养基(PBS或Matrigel混合液)重悬，调整细胞浓度为1-5 × 10^6 cells/mL。台盼蓝染色鉴定活细胞率(>95%)。
   • 接种： 裸鼠背部或右侧腋下皮肤消毒。使用1mL注射器抽取适量细胞悬液(通常100 μL含1-5 × 10^6个细胞)，皮下注射。接种点标记。
   • 分组： 设立接种SW1990-RFP细胞的实验组及阴性对照组(接种培养基或未标记SW1990细胞)。

4. 模型监测与评价：

   • 荧光成像监测：
     • 使用小动物活体荧光成像系统定期(每周1-2次)监测裸鼠。
     • 成像前5分钟腹腔注射荧光成像麻醉剂(如异氟烷)。
     • 将裸鼠置于成像腔，选择与所用RFP匹配的激发/发射滤光片组进行成像。
     • 软件量化感兴趣区域(ROI)的平均荧光强度或总光子通量(TPS)，评估肿瘤生长。
   • 肿瘤体积测量：
     • 每周2-3次用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)。
     • 肿瘤体积(V)计算公式：V = (a × b²) / 2 (单位：mm³)。
   • 大体观察： 每日观察裸鼠精神状态、活动、饮食饮水及体重变化。
   • 终点实验与样本采集：
     • 当肿瘤体积达到预设终点(通常>1000 mm³或符合伦理委员会规定)或动物出现明显痛苦体征时，麻醉后处死裸鼠。
     • 剥离肿瘤组织，拍照记录。
     • 部分肿瘤组织立即用于活体荧光成像或冰冻切片荧光显微镜观察。
     • 部分组织置于4%多聚甲醛中固定，用于石蜡包埋及后续HE染色、免疫组织化学(IHC)分析(如检测CK19、Ki67等胰腺癌及增殖标志物)。
     • 部分组织速冻于液氮中保存，用于分子生物学分析。
   • 统计学分析： 采用GraphPad Prism等软件，数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析等。P < 0.05认为差异有统计学意义。

二、结果

1. SW1990-RFP稳转细胞株构建成功：

   • 流式细胞术检测显示，筛选后SW1990-RFP细胞中RFP阳性细胞比例稳定在98%以上。
   • 荧光显微镜下细胞呈现清晰明亮的红色荧光，形态未受影响。
   • CCK-8实验表明SW1990-RFP细胞与亲本SW1990细胞增殖曲线无显著差异(P > 0.05)，证明标记过程未显著改变细胞增殖能力。

2. 皮下移植瘤模型建立高效：

   • SW1990-RFP细胞接种后约7-14天，在大多数接种点(成瘤率通常>90%)可肉眼观察到微小肿块。
   • 小动物活体荧光成像系统可清晰地在肿块形成初期即检测到局部强烈的红色荧光信号(通常在接种后第3-7天即可检出)，远早于肉眼或触诊发现肿瘤(图1典型成像图)。

3. 肿瘤生长动态监测：

   • 活体荧光成像监测显示，随着时间推移，接种部位的荧光信号强度显著增强，荧光范围不断扩大，直观反映肿瘤的生长过程(图1典型生长曲线)。荧光强度与游标卡尺测量的肿瘤体积呈显著正相关(P < 0.001)。
   • 肿瘤生长曲线显示，SW1990-RFP皮下瘤在裸鼠体内呈近似指数增长趋势(图2肿瘤生长曲线图)。

4. 解剖学及组织学验证：

   • 解剖裸鼠，可见皮下接种部位形成边界相对清晰的实体瘤，瘤体呈淡红色或灰白色，质地中等偏硬。瘤体周围可见丰富血管生成。
   • 剥离的肿瘤组织在体外仍呈现明亮的红色荧光。
   • 冰冻切片或石蜡切片经荧光显微镜观察，可见肿瘤组织内大量细胞表达红色荧光蛋白。
   • HE染色显示肿瘤细胞呈腺样或实性片状排列，细胞异型性明显，核大深染，核分裂象易见，符合低分化腺癌特征。
   • IHC分析显示肿瘤细胞表达CK19等胰腺癌上皮标记物，Ki67标记指数高，证实为来源于SW1990的人胰腺癌组织。

三、讨论

1. 模型优势：

   • 可视化监测： RFP标记使肿瘤生长过程可在体、实时、无创或微创地通过活体成像进行监测，能够更早（在肉眼可见之前）发现肿瘤形成，实现对微小病灶和早期转移灶的灵敏检测，动态追踪肿瘤生长速率和药物反应。
   • 定量精准： 荧光强度可作为肿瘤负荷的定量指标，减少传统体积测量中由于肿瘤形状不规则或软组织影响带来的误差。
   • 操作便捷： 皮下接种操作简便，技术难度低，易于，成瘤率高。
   • 定位明确： 肿瘤位于皮下，易于观察、测量和取材。
   • 稳定可靠： 稳定表达RFP的细胞确保了信号长期持续稳定，避免了染料标记随时间衰减的问题。裸鼠缺乏T细胞功能，避免了人源肿瘤细胞被免疫清除，确保高成瘤率。
   • 应用广泛： 该模型特别适用于评估抗肿瘤药物疗效（监测肿瘤生长抑制或消退）、研究肿瘤转移（通过成像追踪潜在的荧光阳性转移灶）、探索肿瘤血管生成及分子靶向治疗等。

2. 局限性：

   • 免疫缺陷环境： 裸鼠缺乏成熟的T淋巴细胞，无法模拟人体免疫系统对抗肿瘤的过程，限制了其在免疫治疗研究中的应用。
   • 皮下微环境差异： 肿瘤生长在皮下组织，其微环境（如基质细胞、血管、细胞因子网络）与原位（胰腺内）存在显著差异，可能影响肿瘤的生物学行为和药物反应。
   • 自发荧光干扰： 动物毛发、皮肤、食物（如叶绿素）或肠道内容物可能存在自发荧光，干扰成像结果，需注意屏蔽背景或使用光谱分离技术。
   • 成像深度限制： 荧光成像的组织穿透深度有限（通常<1-2 cm），对于深部器官的原位瘤或微小深层转移灶的检测能力不足。
   • 成本与技术： 构建稳转细胞株和小动物活体成像设备较为昂贵，需要专门的技术与操作人员。

3. 意义与应用前景：
   本研究成功建立了红色荧光标记SW1990细胞的裸鼠皮下移植瘤模型。该模型结合了荧光标记的可视化优势与皮下移植瘤的操作简便性，为胰腺癌研究，特别是涉及肿瘤生长动力学、药物筛选、疗效评价、转移机制早期探索等方面，提供了一个直观、灵敏、高效的体内研究平台。克服其局限性（如结合原位模型或人源化免疫模型）将是未来发展的重要方向。

四、结论

本研究成功构建并评价了红色荧光标记人胰腺癌细胞SW1990的裸鼠皮下移植瘤模型。该模型利用红色荧光蛋白标记实现了肿瘤生长的在体、实时、可视化监测，具有成瘤率高、操作简便、定位明确、定量相对精准等优点。体内外实验证实SW1990-RFP细胞保持了亲本细胞的增殖能力和肿瘤生物学特性，形成的移植瘤组织病理学明确为人胰腺癌。该模型为胰腺癌研究，尤其是肿瘤生长监测、抗肿瘤药物体内评价及转移机制初步探索提供了有力的工具。

图注：

• 图1： 皮下接种SW1990-RFP细胞裸鼠的典型活体荧光成像图。(从左至右分别为接种后第7、14、21、28天成像图，显示接种部位荧光信号随肿瘤生长逐渐增强、范围扩大)。
• 图2： SW1990-RFP皮下移植瘤生长曲线。(横轴：时间（天），纵轴：肿瘤体积（mm³）/平均荧光强度（A.U.），显示荧光强度变化曲线与肿瘤体积增长曲线高度吻合)。

参考文献：
（此处列出主要参考文献，如关于胰腺癌模型、荧光标记技术、裸鼠应用、SW1990细胞特性等的核心文献，注意仅引用公开学术文献，不包含企业技术手册或商业宣传资料）