蛋白质N/C端测序

蛋白质N/C端测序：解析蛋白质的“起点”与“终点”

蛋白质是生命活动的主要执行者，其结构与功能息息相关。如同一条有方向性的链条，蛋白质具有特定的氨基端（N端）和羧基端（C端）。准确测定蛋白质或多肽的N端和C端氨基酸序列信息，是蛋白质鉴定、质量控制、结构功能研究以及翻译后修饰分析中至关重要的环节。

一、 N端测序：揭示蛋白质的起始密码

N端测序主要确定蛋白质或多肽链起始部分的氨基酸序列。其经典方法基于Edman降解化学原理：

1. Edman降解（化学法）：

   • 原理： 利用异硫氰酸苯酯（PITC）在碱性条件下与蛋白质或多肽暴露的游离N端α-氨基共价结合，形成苯氨基硫甲酰基（PTC）衍生物。然后在酸性条件下，该衍生物环化并从肽链上特异性切割下N端第一个氨基酸，形成不稳定的苯乙内酰硫脲氨基酸（ATZ-AA），后者进一步转化为更稳定的苯乙硫脲氨基酸（PTH-AA）。
   • 过程： 切割下来的PTH-AA通过高效液相色谱（HPLC）进行分离和鉴定（通过与标准品比对保留时间）。剩余的肽链暴露出新的N端，重复上述循环（偶联、切割、转化、鉴定），即可依次测定后续的氨基酸序列。
   • 特点： 经典、成熟、通量低（一次一个样品）、序列读取长度有限（通常30-60个氨基酸），对样品纯度要求高。N端封闭（如乙酰化、焦谷氨酸化）会阻断反应。

2. 质谱法：

   • 原理： 利用质谱技术分析蛋白质或多肽。通过特异性标记（如同位素标记或化学标记）N端氨基或采用特殊的酶解/化学裂解方法，结合串联质谱（MS/MS）分析，可以推导出N端序列。
   • 方法：
     • 结合酶解/化学裂解： 使用只在特定氨基酸位点切割的酶（如胰蛋白酶切Lys/Arg的C端）或化学试剂（如溴化氰切Met的C端），结合末端特异性标记，通过分析产生的肽段质量及碎片信息推断N端序列。
     • N端特异性标记： 使用化学试剂（如亚氨基环己酮）选择性修饰N端氨基，再进行酶解和质谱分析。标记肽段在质谱中具有特征质量偏移或碎片模式。
     • 从头测序（De Novo Sequencing）： 在缺乏数据库信息时，直接利用MS/MS谱图中连续产生的b/y离子系列碎片信息，通过计算推导出完整的肽段序列，包括N端信息。需要高质量的谱图和先进的数据分析软件。
   • 特点： 通量高、速度快、可与C端分析结合进行、能处理N端封闭样品（需特殊方法如酶法去封闭）、对样品纯度要求相对较低（尤其适用于混合物）、读取长度取决于肽段大小和谱图质量。

二、 C端测序：探索蛋白质的终止信号

C端测序的技术挑战更大，发展相对滞后于N端测序，但同样重要，尤其对于验证C端翻译后修饰（如酰胺化、糖基磷脂酰肌醇锚定GPI）和鉴定截短体至关重要。

1. 化学降解法（传统方法）：

   • 原理： 历史上曾使用类似Edman降解的化学方法，如阿克姆扬诺夫反应（使用肼、三氟乙酸酐等试剂）。这些方法通常效率较低、副反应多、序列读取长度非常短（通常1-3个氨基酸），且对样品要求苛刻，现已很少应用。

2. 羧肽酶法（酶解法）：

   • 原理： 使用羧肽酶（Carboxypeptidase），这类酶能从多肽链的C端依次水解释放出游离的氨基酸。
   • 过程： 将蛋白质/多肽与羧肽酶（如羧肽酶A、B、Y、P）孵育，在不同时间点取样，通过分析释放出的游离氨基酸种类和顺序（常用HPLC或质谱检测），推断C端序列。
   • 特点： 相对温和、可测定多个氨基酸。缺点在于酶解速率受C端氨基酸种类影响很大（酶有特异性），难以准确控制时间点以确定精确顺序，且可能发生内部切割（蛋白酶污染或特异性不绝对），导致结果复杂化。通量低。

3. 质谱法（主流方法）：

   • 原理： 结合特异性标记C端羧基或利用特殊的裂解/活化技术，使质谱在碎裂过程中产生能反映C端序列信息的特征碎片离子。
   • 方法：
     • 结合酶解/化学裂解： 原理类似N端质谱法，通过分析特定裂解产生的包含C端的肽段来推断。常用Lys-C（切Lys的C端）或Asp-N（切Asp的N端）等酶。
     • C端特异性标记： 使用化学方法（如乙酸酐、丙酸酐）或酶法（如羧肽酶Y在特定条件下）选择性修饰C端羧基。标记后的肽段在MS/MS中产生特征碎片（如优先产生C端离子）。
     • 电子转移解离/电子捕获解离（ETD/ECD）： 这类软电离碎裂技术比传统的碰撞诱导解离（CID）更能保留不稳定的翻译后修饰，并能产生更连续的c/z离子系列碎片，特别适合从头测序和C端序列分析，尤其对于带正电荷的肽段。
     • 从头测序（De Novo Sequencing）： 同样适用于C端序列测定，通过解析MS/MS谱图中的c/z离子系列（ETD/ECD）或y离子系列（CID）来推导C端序列。
   • 特点： 高灵敏度、通量潜力大、能分析C端修饰、是当前C端测序的主流和最有前景的方向。

三、 N端与C端测序的应用价值

1. 蛋白质鉴定与验证： 确认重组蛋白或合成多肽的N端和C端序列是否正确，是质量控制的关键指标。比对实测序列与理论序列，验证目标蛋白身份。
2. 发现翻译后修饰： 识别N端乙酰化、焦谷氨酸化、C端酰胺化、糖基化等重要修饰。这些修饰影响蛋白质的稳定性、定位和功能。
3. 检测加工与降解： 发现信号肽切除不完全、蛋白酶解产生的N/C端截短或延长，为研究蛋白质成熟过程、降解途径和疾病机制提供线索。
4. 结构域定位与功能研究： N/C端序列信息有助于确定结构域边界，辅助结构建模和功能预测。
5. 发现新蛋白与变异体： 对于数据库中不存在的蛋白质或存在序列变异的蛋白（如剪接变体、突变体），N/C端测序（尤其是从头测序）是获取其末端序列信息的重要手段。
6. 抗体表征： 单克隆抗体的重链和轻链具有特定的N端和C端序列（恒定区），测序是确认其正确性和一致性的重要步骤。

四、 方法选择与发展趋势

• 选择依据： 选择N端或C端测序方法需考虑样品类型（纯度、量）、目标（仅需末端几个还是较长序列、是否需要检测修饰）、成本、通量要求以及现有设备条件。
• Edman降解： 对于高纯度、未封闭的样品，需要确定前10-20个精确序列时仍有价值。
• 质谱法： 已成为N端和C端测序的绝对主流，尤其适用于复杂样品、高通量分析、修饰检测和从头测序。其高灵敏度、高速度和与其它组学技术联用的能力是巨大优势。
• 发展趋势：
  • 更高灵敏度与通量： 质谱仪器的不断进步（如Orbitrap, timsTOF等）和自动化样品处理提升通量和检出限。
  • 更优的碎裂技术： EThcD（ETD与补充活化结合）等混合碎裂模式提供更完整、更易解析的碎片信息。
  • 更强大的生物信息学： 从头测序算法、修饰搜索算法、以及整合N/C端信息的分析软件持续发展，提高序列解析的准确性和效率。
  • C端测序新方法： 基于化学标记和特异性富集的C端组学方法仍在探索中，旨在实现更高通量、更特异的C端肽段分析。

总结

蛋白质N端和C端测序是解析蛋白质“身份”与“完整性”的关键钥匙。从经典的Edman降解和羧肽酶法，到如今以质谱技术为核心的主流方法，技术的进步极大地拓展了我们获取蛋白质末端信息的能力。质谱法凭借其高灵敏度、高通量、对修饰的分析能力以及与其它技术联用的优势，已成为N端测序的常规方法和C端测序发展的主要驱动力。随着仪器性能的提升和生物信息学工具的完善，N/C端测序将在蛋白质组学、生物制药、基础研究和临床诊断等领域发挥越来越重要的作用，持续深化我们对蛋白质结构与功能的理解。