蛋白分子量测定：方法与原理详解
蛋白质分子量测定是生物化学、分子生物学及蛋白质组学研究中的基础环节，其结果对理解蛋白质结构、功能、相互作用以及后续的纯化鉴定至关重要。目前，科学家们主要依赖以下几种技术进行精确测定：
一、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
- 原理： 蛋白质样品在含有阴离子去污剂SDS和还原剂的缓冲液中加热变性。SDS使蛋白质带大量负电荷，掩盖其原有电荷差异；还原剂断裂二硫键，使蛋白质解聚成单条肽链。随后在聚丙烯酰胺凝胶电场中迁移，迁移速率主要取决于分子量大小。
- 优点：
- 操作简便，成本低，设备普及。
- 可同时分析多个样品。
- 能直观显示蛋白质纯度和大致分子量。
- 缺点：
- 精确度有限（相对误差约5-10%）。
- 不能区分分子量非常接近的蛋白质。
- 无法测定天然状态下的分子量（因变性）。
- 需要分子量标准品（Marker）。
- 应用： 最常用的初步筛选和估算方法，尤其在实验室日常分析中。
二、凝胶过滤色谱/尺寸排阻色谱 (GFC/SEC)
- 原理： 蛋白质溶液流经填充满多孔凝胶颗粒的色谱柱。不同大小的蛋白质分子在流经过程中，小分子能进入更多孔洞，路径长，保留时间长；大分子被排阻在孔外，路径短，保留时间短。分子量通过与已知分子量标准品洗脱体积的比较确定。
- 优点：
- 可在接近生理条件下（非变性）测定蛋白质的流体力学体积（斯托克斯半径），适用于研究天然状态蛋白质及寡聚体。
- 可同时进行纯化和分子量测定。
- 精确度优于SDS-PAGE（相对误差约5%）。
- 缺点：
- 需要标准品建立校准曲线。
- 分子形状（球形/棒状）影响结果，非球形蛋白结果可能偏离真实分子量。
- 色谱柱成本较高，耗时较长。
- 应用： 研究蛋白质在溶液中的天然构象、寡聚状态、蛋白质-蛋白质相互作用。
三、质谱法 (Mass Spectrometry, MS)
质谱法是目前测定蛋白质分子量最精确、最强大的技术，尤其适用于复杂样品和高通量分析。主要分为两类：
-
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS):
- 原理： 蛋白质样品与吸光基质混合并干燥成结晶。激光脉冲照射使基质吸收能量并汽化，同时将包裹的蛋白质分子软电离成带单电荷或多电荷的气相离子。离子在电场中加速，根据质荷比(m/z)不同，在无场飞行管中的飞行时间不同，小分子飞行时间短，大分子飞行时间长。通过检测飞行时间换算分子量。
- 优点：
- 测定范围广（可达数百万道尔顿）。
- 灵敏度高，样品量少。
- 耐受一定量的盐和缓冲液。
- 谱图相对简单（主要产生单电荷或低电荷峰），易于解析。
- 缺点：
- 精确度受基质结晶均一性影响。
- 分辨率通常低于ESI-MS。
-
电喷雾电离质谱 (Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS):
- 原理： 蛋白质溶液在高电压下通过毛细管喷出形成带电液滴，溶剂蒸发使液滴收缩，库仑排斥力导致液滴裂解，最终产生带多电荷的气相蛋白质离子。这些离子进入质量分析器（常与TOF、四极杆、离子阱、Orbitrap联用），按质荷比(m/z)分离检测。通过计算同一分子不同电荷态的多个峰，反推出精确分子量。
- 优点：
- 精确度极高（误差通常小于0.01%），分辨率高。
- 可与液相色谱联用（LC-ESI-MS），直接分析复杂混合物。
- 可提供多电荷信息，有助于分析大分子。
- 可在较温和条件下电离，适用于研究弱相互作用复合物（非共价复合物质谱）。
- 缺点：
- 对样品纯度要求较高，易受盐和去污剂抑制。
- 谱图复杂（多电荷峰簇），需要解卷积软件处理。
- 仪器成本高，操作相对复杂。
- 质谱应用：
- 精确测定完整蛋白质分子量（包括翻译后修饰导致的微小质量变化）。
- 鉴定蛋白质（通过肽质量指纹图或串联质谱测序）。
- 分析蛋白质复合物（非共价相互作用）。
- 蛋白质组学大规模鉴定和定量。
四、其他方法
- 沉降平衡超速离心： 经典方法，在严格热力学平衡状态下测定分子量，结果非常准确，是研究溶液中蛋白质均一性、缔合状态的金标准之一。但耗时极长，操作复杂，已较少用于常规分子量测定。
- 小角X射线散射 (SAXS)： 可提供溶液中蛋白质的整体形状和分子量信息，但需要同步辐射光源或高强度实验室光源，数据分析复杂。
- 静态光散射 (SLS) + SEC (SEC-MALS)： 将尺寸排阻色谱与多角度激光光散射检测器联用。SEC分离组分后，SLS直接测定溶液中蛋白质的绝对分子量（无需标准曲线）和旋转半径。克服了SEC单独使用需标准品的缺点和形状影响，是测定溶液中天然蛋白质分子量和构象的有力工具。
选择测定方法的考虑因素
- 所需精确度： 高精度首选质谱（尤其ESI-MS）或SEC-MALS。
- 样品状态： 变性状态用SDS-PAGE；天然状态用SEC、SEC-MALS、沉降平衡、非变性质谱。
- 样品复杂度： 简单样品各种方法均可；复杂混合物首选LC-ESI-MS或SDS-PAGE（需切胶分析）。
- 研究目的： 仅需估算用SDS-PAGE；研究修饰用质谱；研究寡聚态用SEC、SEC-MALS、沉降平衡、非变性质谱。
- 成本与设备： SDS-PAGE最经济简便；质谱和SEC-MALS设备昂贵。
关键注意事项
- 样品纯度： 杂质会严重影响所有方法的准确性，尤其是质谱和色谱法。测定前需充分纯化。
- 样品缓冲液： 高盐、去污剂、甘油等会干扰电泳、色谱和质谱分析。测定前需置换到兼容的缓冲液中（如质谱常用挥发性缓冲液甲酸铵、醋酸铵）。
- 分子量标准品： SDS-PAGE和SEC必须使用准确可靠的分子量标准品进行校准。
- 蛋白质特性： 糖基化、磷酸化等翻译后修饰会增加实际分子量；二硫键影响SDS-PAGE结果（需还原处理）；极端氨基酸组成（如富含脯氨酸）或特殊结构域可能影响迁移行为。
- 结果解读： SDS-PAGE、SEC给出的是相对分子量或表观分子量；质谱（尤其ESI-MS）和SEC-MALS给出的是绝对分子量。理解方法原理和局限性对正确解读结果至关重要。
总结
蛋白分子量测定技术各具特色。SDS-PAGE凭借其简便、直观、高通量和低成本，仍是实验室日常估算的基石。凝胶过滤色谱在非变性和寡聚体研究中不可或缺。质谱技术，尤其是ESI-MS和MALDI-TOF MS，凭借其超高精度、高灵敏度和强大的分析能力，已成为精确测定分子量（包括修饰）和蛋白质鉴定的核心工具。联用技术如SEC-MALS则提供了在溶液中测定绝对分子量和构象信息的强大手段。研究者应根据具体实验目的、样品性质和对精度的要求，选择最合适的方法或方法组合。
参考文献
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