A/California/07/2009 (H1N1) 滴鼻感染白来航鸡模型的建立与评估
摘要：
本研究成功建立并评估了使用 A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 流感病毒经滴鼻途径感染白来航鸡的动物模型。通过监测临床症状、体重变化、体温、病毒排出及组织病毒载量等指标，系统评价了该病毒在白来航鸡体内的感染动力学和致病性。结果显示，该毒株在白来航鸡中可引起轻度、可的感染，主要局限于呼吸道，无明显全身性致病或死亡。此模型为研究 2009 年甲型 H1N1 流感大流行病毒在禽类中的适应性、传播潜力及宿主限制机制提供了重要工具。
关键词： 甲型流感病毒；H1N1 pdm09；A/California/07/2009；白来航鸡；动物模型；滴鼻感染；病毒排出；宿主限制
引言
2009 年爆发的甲型 H1N1 流感大流行病毒 (pdm09) 起源于猪流感病毒，其基因组包含禽源、人源和猪源流感病毒的片段。尽管主要导致人类感染，pdm09 病毒也被证实能够感染多种动物，包括猪、雪貂、非人灵长类动物以及家禽。了解 pdm09 病毒在禽类宿主中的感染特性、能力和传播潜力，对于评估其公共卫生风险和生态学意义至关重要。
白来航鸡 (White Leghorn chicken) 作为禽流感研究的经典模型，被广泛应用于评估不同亚型流感病毒对家禽的致病性和传播能力。本研究旨在利用 A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 病毒株，通过滴鼻途径感染白来航鸡，建立稳定的感染模型，并详细描述其感染过程、病毒特征和宿主反应，为深入探究该病毒与禽类宿主的相互作用提供基础。
材料与方法
- 病毒： 使用 A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 病毒株。病毒在无特定病原体（SPF）的鸡胚尿囊腔中增殖，收获尿囊液，测定其鸡胚半数感染量 (EID₅₀) 后分装，-80°C 保存备用。
- 实验动物： 选用 4-6 周龄 SPF 白来航鸡。实验前经血清学检测确认无禽流感病毒、新城疫病毒等常见禽病原体感染。所有动物实验操作均遵循所在研究机构动物伦理委员会批准的方案进行。
- 实验分组与感染：
- 将鸡只随机分为感染组和对照组。
- 感染组：使用无菌生理盐水将病毒原液稀释至 10⁶ EID₅₀/mL。每只鸡经滴鼻途径接种 0.1 mL 病毒稀释液（含 10⁵ EID₅₀）。
- 对照组：每只鸡经滴鼻途径接种 0.1 mL 无菌生理盐水。
- 临床观察与样品采集：
- 临床评分： 每天观察并记录感染组和对照组鸡只的精神状态、食欲、呼吸状况、羽毛状况、眼部及鼻部有无分泌物、粪便性状等。根据预定的评分标准进行临床症状评分（0 分：健康；1-3 分：轻度症状；≥4 分：明显症状）。
- 体重： 于感染前（0 dpi）及感染后第 1、3、5、7 天（dpi）称量鸡只体重，计算体重变化率。
- 体温： 在相同时间点（0, 1, 3, 5, 7 dpi）使用直肠测温计测量鸡只体温。
- 病毒排出： 在 1, 3, 5, 7 dpi 采集感染组和对照组鸡只的喉拭子和泄殖腔拭子，置于含抗生素的病毒运输液中，立即冰上保存，用于病毒滴定。
- 组织样品： 在 3 dpi 和 5 dpi（感染高峰期），分别对部分感染组和对照组鸡只实施安乐死，无菌采集鼻甲骨、气管、肺脏、脾脏、肾脏、脑组织。部分组织立即用于病毒滴定，部分固定于 10% 中性福尔马林溶液用于病理学检查。
- 病毒滴定：
- 将拭子样品和组织匀浆上清液进行系列 10 倍稀释。
- 接种于 9-11 日龄 SPF 鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种 3-5 枚鸡胚。
- 33-35°C 孵育 72 小时。
- 收获尿囊液，采用血凝（HA）试验检测病毒血凝活性。根据 Reed-Muench 法计算病毒滴度，以每毫升样品或每克组织中的 EID₅₀ 或 log₁₀ EID₅₀ 表示。
- 病理学检查： 福尔马林固定的组织经脱水、包埋、切片、HE 染色后，在光学显微镜下观察组织病理学变化。
- 统计分析： 使用适当的统计软件进行数据分析。体重变化、体温、病毒滴度等计量资料采用 t 检验或方差分析（ANOVA）比较组间差异。P < 0.05 被认为具有统计学显著性差异。
结果
- 临床症状与体重变化：
- 感染组鸡只在感染后 1-5 dpi 期间，部分个体出现轻微的、短暂的临床症状，包括精神稍差、活动减少、食欲轻度下降，偶见轻微眼结膜炎或鼻分泌物增多。临床评分显著高于对照组（P < 0.05），但所有评分均低于 3 分，表明症状非常轻微。所有感染鸡只均未出现严重呼吸道症状、神经系统症状或死亡。
- 对照组鸡只无任何临床症状。
- 感染组鸡只在 1-3 dpi 期间平均体重略有下降或增长停滞（与 0 dpi 相比），平均体重变化率在 3 dpi 时显著低于对照组（P < 0.05）。但自 5 dpi 起，体重恢复增长，至 7 dpi 时体重变化率与对照组已无显著差异（P > 0.05）。整个观察期内无体重严重下降现象。
- 体温变化： 感染组鸡只在 1-3 dpi 期间平均体温呈现轻度、短暂的升高（平均升高约 0.5-1.0°C），在 3 dpi 时达到峰值，显著高于感染前（0 dpi）水平和同期对照组水平（P < 0.05）。体温在 5 dpi 开始回落，至 7 dpi 恢复至正常水平。对照组体温无明显波动。
- 病毒排出：
- 喉拭子： 病毒排出最早在 1 dpi 即可检测到，排毒高峰出现在 3 dpi 和 5 dpi，平均病毒滴度最高可达约 10³.⁵ EID₅₀/mL。排毒持续至 7 dpi，但滴度显著下降。对照组喉拭子始终未检测到病毒。
- 泄殖腔拭子： 仅在个别感染鸡只的 3 dpi 和 5 dpi 泄殖腔拭子中检测到低滴度的病毒（通常低于 10² EID₅₀/mL），大部分鸡只泄殖腔拭子病毒检测为阴性。对照组泄殖腔拭子均为阴性。
- 组织病毒载量：
- 呼吸道组织： 在 3 dpi 和 5 dpi 采集的鼻甲骨、气管和肺脏组织中均检测到较高水平的病毒。病毒载量在 3 dpi 较高，5 dpi 有所下降。其中，气管和肺脏的病毒滴度通常高于鼻甲骨。各时间点感染组呼吸道组织病毒滴度显著高于对照组（P < 0.001）。
- 非呼吸道组织： 在脾脏、肾脏、脑组织中，仅在极少数感染鸡只检测到痕量病毒（接近检测限），或完全检测不到病毒。感染组与对照组在这些组织中的病毒滴度无显著差异（P > 0.05）。
- 病理学变化： 组织病理学检查显示，感染组鸡只在 3 dpi 和 5 dpi 的鼻甲骨、气管和肺脏组织可见轻度至中度的炎症反应。主要表现为：
- 鼻甲骨/气管： 粘膜上皮细胞轻度肿胀、变性、偶见少量脱落；固有层和粘膜下层轻度充血、水肿，伴有少量淋巴细胞、单核细胞浸润。
- 肺脏： 部分细支气管上皮细胞变性、坏死、脱落；管腔及周围肺泡腔可见少量炎性细胞（淋巴细胞、巨噬细胞）浸润和渗出；局灶性轻度间质性肺炎。脾脏、肾脏、脑组织未见与病毒感染相关的特异性病理变化。对照组所有组织均未见明显病变。
讨论
本研究成功建立了 A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 病毒经滴鼻感染白来航鸡的动物模型。结果显示，该病毒能够在白来航鸡的上呼吸道和下呼吸道进行有效，并引起轻微的、自限性的呼吸道感染，表现为短暂的轻微临床症状、轻度体温升高和短暂的体重增长停滞。病毒主要通过呼吸道排出，排毒高峰在感染后 3-5 天，泄殖腔排毒较少且滴度低。病毒主要局限于呼吸道组织（鼻甲骨、气管、肺），在非呼吸道内脏器官和中枢神经系统中能力极弱或无法，未引起全身性感染。相应的病理变化也局限于呼吸道，呈现轻中度炎症反应。
这些特征与已知的 pdm09 病毒在禽类中的感染特性相符。该病毒在禽类中的效率低于禽流感病毒（如高致病性 H5N1），致病性也远低于高致病性禽流感病毒。其有限的能力和组织嗜性反映了禽类宿主对其存在的限制性因素，可能与禽类呼吸道和肠道细胞表面主要分布的唾液酸 α-2,3 半乳糖苷受体（主要结合禽流感病毒）与 pdm09 病毒偏好结合的唾液酸 α-2,6 半乳糖苷受体（主要存在于人上呼吸道）之间的不匹配有关。此外，禽类宿主的固有免疫和适应性免疫反应也可能限制其和扩散。
本模型的建立具有重要价值：
- 评估传播潜力： 可作为基础模型，通过共居或直接接触实验，评估 pdm09 病毒在白来航鸡群体内的水平传播能力。
- 研究宿主限制机制： 可用于深入研究病毒蛋白（如 HA、PB2、NP）的分子决定簇如何影响病毒在禽类细胞中的效率和组织嗜性，揭示跨物种传播的分子基础。
- 评估疫苗与抗病毒药物： 可作为平台，初步评估针对 pdm09 病毒的候选疫苗或抗病毒药物在禽类模型中的保护效果或治疗效果。
- 监测病毒演化： 有助于监测在自然界（特别是猪或人）中循环的 pdm09 病毒或其变种在禽类中适应性变化的趋势，为风险评估提供依据。
结论
本研究证实 A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 病毒能够通过滴鼻途径感染白来航鸡，并在其呼吸道进行有限，引起轻微的自限性呼吸道疾病，但不导致严重发病或死亡。病毒主要局限于呼吸道，通过喉部大量排毒，泄殖腔排毒少。该感染模型稳定可靠，重现性好，为深入研究 2009 年甲型 H1N1 大流行流感病毒在禽类宿主中的生物学特性、跨物种传播机制、宿主限制因素以及防控策略提供了重要的实验平台。未来研究可进一步利用该模型探索病毒的传播能力及其分子决定因素。
