A/Brambling/Beijing/16/2012（H9N2）病毒株经滴鼻途径感染雪貂模型的实验研究
摘要：
本研究利用雪貂模型评估了禽源H9N2流感病毒株A/Brambling/Beijing/16/2012 (BJ/16)的感染性和致病性。通过滴鼻途径接种BJ/16病毒，雪貂表现出温和的临床症状（体温短暂升高、活动减少），并在鼻甲和气管中检测到有效的病毒（滴度 > 4 log<sub>10</sub> TCID<sub>50</sub>/g），同时伴随血清特异性抗体应答。直接接触传播试验表明该毒株具备有效的雪貂间传播能力。研究结果为评估H9N2亚型的公共卫生风险提供了重要实验依据。
引言：
H9N2亚型禽流感病毒在欧亚大陆家禽中广泛流行，呈现出地方性流行态势。因其内部基因作为“基因供体”频繁参与新型重配病毒（如H7N9、H10N8等）的形成，并对哺乳动物宿主适应性不断增强，其潜在的大流行风险备受关注。雪貂是研究流感病毒感染、传播和致病性的黄金标准模型。本研究旨在利用雪貂模型，系统评估禽源H9N2病毒株BJ/16通过自然呼吸道途径（滴鼻）的感染能力、在雪貂呼吸道组织的水平、诱导的致病性以及人际传播潜力。
材料与方法：
-
病毒：
- 病毒株：A/Brambling/Beijing/16/2012 (H9N2) (BJ/16)。该毒株分离自北京地区的燕雀。
- 扩增与滴定：病毒在9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔中37℃培养48-72小时扩增。收获的尿囊液经离心澄清，分装后于-80℃保存。病毒滴度采用组织细胞半数感染剂量（TCID<sub>50</sub>）法在MDCK细胞上进行测定。
-
动物与伦理：
- 动物：6-8月龄、流感血清学阴性的雪貂（Mustela putorius furo）。
- 分组：
- 感染组 (n=3-4)： 经滴鼻途径接种BJ/16病毒（10<sup>6.0</sup> TCID<sub>50</sub>/ml，1ml/只）。
- 接触传播组： 感染后24小时，每只感染雪貂与1只初始健康血清阴性雪貂同笼饲养。
- 对照组 (n=2)： 接种等体积无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 饲养：所有雪貂在负压隔离器内单独饲养，提供充足食物和水。实验期间密切监测动物福利。
- 伦理：本研究方案经机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查批准，遵循动物福利准则进行。
-
感染与监测：
- 滴鼻接种： 雪貂经异氟烷轻度麻醉后，使用移液器将病毒悬液（或PBS）缓慢滴入鼻腔（每侧鼻孔约0.25ml）。
- 临床症状： 接种后连续14天每日观察并记录体温、体重变化、活动状态、食欲、呼吸状况（如咳嗽、喷嚏、呼吸困难）及鼻腔分泌物情况。
- 样本采集：
- 鼻洗液/拭子： 于接种后第1、3、5、7天（或根据实验设计）采集，置于病毒运输液中，用于病毒脱落检测。
- 组织样本（安乐死后）： 选定时点（如感染后第3、5、7天）对部分感染组和对照组雪貂实施安乐死（过量巴比妥类药物），无菌采集鼻甲、气管、肺等组织，称重后制备匀浆液。
- 病毒滴定： 鼻洗液/拭子样本、组织匀浆上清液采用TCID<sub>50</sub>法在MDCK细胞上测定病毒滴度。
-
血清学检测：
- 血清采集： 于感染前（0天）和感染后第14天（或终末）采集血液，分离血清。
- 血凝抑制试验 (HI)： 使用0.5%鸡红细胞及BJ/16病毒抗原，检测血清中特异性抗体的HI滴度。滴度≥40判为阳性。
-
传播评估：
- 直接接触组雪貂与接种雪貂同笼饲养后，按感染组相同方案进行临床症状观察及鼻洗液样本采集（每日或隔日），检测病毒脱落情况。
- 接触传播成功的判定标准：接触雪貂在监测期内至少连续两天鼻腔样本病毒检测阳性（滴度 ≥ 1 log<sub>10</sub> TCID<sub>50</sub>/ml），或终末血清HI抗体阳性。
结果：
-
BJ/16病毒在雪貂呼吸道有效：
- 病毒脱落： 所有滴鼻接种BJ/16病毒的雪貂均发生感染。鼻腔病毒脱落高峰出现在接种后第3-5天，平均滴度可达4.5-5.2 log<sub>10</sub> TCID<sub>50</sub>/ml，持续脱落时间约5-7天。
- 组织病毒载量： 感染后第3天和第5天，在鼻甲和气管组织中检测到高滴度的病毒（平均滴度 > 4 log<sub>10</sub> TCID<sub>50</sub>/g）。肺部组织病毒载量相对较低或检测不到，表明BJ/16病毒主要在上呼吸道。
-
诱导温和的临床症状：
- 感染雪貂在接种后第2-4天出现短暂的体温升高（平均升高约1.0-1.5℃）。
- 部分雪貂表现出轻度活动减少、食欲稍减。
- 未观察到明显的体重下降（< 5%）、严重呼吸道症状（如呼吸困难）或死亡。临床症状在感染后7天内基本恢复。
- 对照组雪貂无任何临床症状。
-
血清学应答：
- 所有感染雪貂在感染后第14天均检测到针对BJ/16病毒的特异性HI抗体，几何平均滴度（GMT）介于80-160之间。
- 对照组雪貂血清抗体始终阴性。
-
BJ/16病毒可在雪貂间有效传播：
- 在所有设置的直接接触传播对（n=3）中，接触雪貂均在暴露后第4-7天开始检测到鼻腔病毒脱落，脱落高峰滴度与接种雪貂相当（4.0-5.0 log<sub>10</sub> TCID<sub>50</sub>/ml）。
- 所有接触雪貂在终末时均检测到HI抗体（GMT ≥ 80），证实均发生感染。接触传播效率为100%。
- 接触感染的雪貂临床表现与滴鼻接种的雪貂类似，均为温和且短暂的症状。
讨论：
本研究结果表明，禽源H9N2病毒株A/Brambling/Beijing/16/2012 (BJ/16) 能够通过滴鼻途径有效感染雪貂模型，并在其上呼吸道（鼻甲、气管）高效。尽管感染仅导致雪貂出现温和、短暂的临床症状（体温升高、活动减少），未表现出严重的下呼吸道疾病或致死性，但其在雪貂呼吸道的高水平和高效的直接接触传播能力（本研究观察到的传播效率为100%）是其公共卫生风险的重要标志。
H9N2病毒在雪貂模型中高效传播的特性，与其近年来在哺乳动物模型（小鼠、豚鼠、雪貂）中日益增强的传播表型相符。这种适应性可能与病毒HA蛋白受体结合特性的改变（如Q226L突变增加对α-2,6唾液酸受体的结合力）、PB2蛋白（如E627K）增强哺乳动物细胞适应性等分子特征相关。BJ/16毒株具备的这种高效传播能力，极大地增加了其在人群中建立持续传播链的风险，特别是在与季节性人流感病毒发生重配时。此外，该毒株在上呼吸道的有效为病毒排出和传播提供了生物学基础。
需要强调的是，H9N2病毒感染雪貂表现出的相对温和的临床症状，与其在人类中通常引起轻度呼吸道感染的流行病学特征一致。然而，其作为新型重配病毒的“内部基因供体”角色更为突出。携带H9N2内部基因的重配病毒（如H5Nx, H7N9）往往表现出更高的致病性或传播性。因此，持续监测H9N2病毒的流行、变异及其在哺乳动物模型中的表现，对于评估和预警潜在的流感大流行威胁至关重要。
结论：
本实验通过雪貂模型证实，禽源H9N2病毒A/Brambling/Beijing/16/2012 (BJ/16) 经滴鼻途径可有效建立感染，在其上呼吸道高效，并诱导特异性体液免疫应答。尽管致病性温和，该毒株展现出了高效的水平接触传播能力。这些结果清晰地凸显了该谱系H9N2病毒对公共卫生构成的潜在风险，强调了对其持续进行严格的流行病学监测和风险评估的必要性。本研究为理解H9N2病毒的哺乳动物适应性和传播潜力提供了重要的实验数据支持。
致谢：
本研究获得了所在机构研究基金的支持。感谢实验动物中心工作人员的专业技术支持。所有作者声明无利益冲突。
