蛋白-小分子共结晶条件筛选 - 中析研究所生物检测中心

蛋白-小分子共结晶条件筛选：原理、策略与挑战

蛋白-小分子复合物的高分辨率三维结构是理解药物作用机制、设计新型化合物以及阐明关键生物学过程的基石。获得这类结构的最核心步骤之一，便是成功实现蛋白与小分子配体的共结晶。与单纯蛋白结晶相比，共结晶过程更为复杂，涉及蛋白、小分子、溶剂以及沉淀剂等多组分间的精细平衡。因此，系统而高效的共结晶条件筛选至关重要。

一、共结晶的本质与挑战

共结晶的目标是让小分子配体结合在蛋白的活性位点或变构位点上，并共同形成有序排列，构成晶体的基本重复单元。这带来了独特的挑战：

小分子结合诱导构象变化： 配体结合可能导致蛋白构象改变（诱导契合），影响其表面性质和结晶倾向。
小分子溶解度与稳定性： 小分子在高浓度沉淀剂环境下的溶解度、化学稳定性（如pH敏感性）以及与溶剂的兼容性需仔细考量。
结合亲和力与占据率： 配体需有足够高的亲和力（通常 Kd < 100 μM）和浓度，确保结合位点在结晶过程中被充分占据。
晶格溶剂效应： 小分子的加入可能干扰原有晶格溶剂的排列，影响晶体堆积和稳定性。
筛选空间庞大： 需同时优化蛋白结晶条件和小分子结合条件，变量组合呈指数级增长。

二、共结晶筛选的核心策略

成功的共结晶筛选通常采用多管齐下的策略：

高质量蛋白样品制备：
- 高纯度 (>95%)： 杂质是结晶的大敌。使用多种层析技术（如亲和、离子交换、分子筛）组合纯化。
- 均一性： 确保蛋白处于单一、稳定的寡聚状态。分子筛层析是评估均一性的金标准。
- 稳定性： 优化缓冲液成分（pH、盐种类及浓度、还原剂、辅因子等）、储存条件（温度、浓度），必要时添加稳定剂（如甘油、氨基酸）。
- 浓度： 通常使用较高浓度（如 5-20 mg/mL），以增加分子碰撞和成核概率，并确保小分子结合位点饱和。
小分子配体准备：
- 溶解性： 选择合适溶剂（如DMSO、甲醇、乙醇、水）溶解配体。DMSO是常用选择（终浓度通常<5%）。
- 浓度： 配体浓度应远高于其Kd值（至少10倍），确保结合位点高度饱和。常用终浓度范围在0.1 - 5 mM。
- 稳定性： 确认配体在结晶缓冲液和筛选条件下（pH、温度）稳定。避免使用可能降解配体的组分。
- 储存： 储备液分装冻存于-20°C或-80°C，避免反复冻融。
复合物形成：
- 预孵育法 (最常用)： 将蛋白与过量小分子配体在结晶前充分混合（室温或4°C孵育30分钟至数小时），形成溶液中的复合物。适用于高亲和力配体。
- 共溶解法： 直接将蛋白溶解在含有高浓度配体的溶液中。适用于溶解度极高的配体或需极高配体浓度的情况。
- 浸泡法 (晶体后浸泡)： 先获得不含配体的蛋白晶体（Apo晶体），再将晶体浸泡在含有高浓度配体的溶液中，让配体扩散进入活性位点。适用于已获得Apo晶体且配体扩散性好的情况，但可能受限于晶体堆积密度。
结晶条件筛选：
- 基于已有蛋白结晶条件： 这是最有效的起点。在已知能长出Apo蛋白晶体的条件下，直接加入小分子进行筛选（“加配体”筛选）。通常需微调pH、沉淀剂浓度等参数。
- 稀疏矩阵商业试剂盒筛选： 使用市售的广谱结晶筛选试剂盒（包含多种沉淀剂、盐、缓冲液、添加剂的组合）。这是探索新条件的有效方法。
- 添加剂筛选： 在已有或接近成功的条件中，系统添加不同类型的添加剂（如离子、小分子、还原剂、去污剂），可能有助于稳定复合物或改善晶体质量。
- pH和温度梯度： 在筛选时设置pH梯度（如±0.5-1.0单位）和温度梯度（如4°C, 12°C, 20°C），增加找到最佳结晶窗口的机会。
- 高通量自动化： 利用液体处理机器人和成像系统进行纳升级别（如96/384孔板）的大规模并行筛选，极大提高效率和节省样品。
结晶方法：
- 悬滴法： 最常用。将蛋白-配体复合物溶液与等体积池液混合，悬于密封池液上方。通过气相扩散达到平衡。
- 坐滴法： 类似悬滴法，混合滴置于池液上方的平台上。操作更简便。
- 油下扩散法： 用于极小体积（如50-200 nL）的结晶，混合滴置于油下，通过油层缓慢扩散达到平衡。
- 批次法： 蛋白溶液直接与结晶溶液混合（无气相扩散）。适用于难结晶体系或筛选沉淀剂浓度。

三、筛选结果分析与优化

晶体识别与初步评估：
- 定期（如每天、隔天、每周）使用显微镜检查结晶板。
- 识别晶体（区别于盐晶、蛋白沉淀）。晶体通常具有规则的几何形状和清晰的棱角。
- 初步评估晶体大小、形状、数量。微晶、针状晶、簇晶可能需要优化。
区分共晶与Apo晶体：
- 形态差异： 共晶体的形态有时（非绝对）与Apo晶体不同。
- X射线衍射： 最终确认必须通过X射线衍射收集数据，计算电子密度图，观察配体密度。这是金标准。
- 荧光扫描 (若适用)： 如果小分子具有天然荧光或标记了荧光基团，可用特定波长光扫描晶体板，共晶可能显示荧光。
晶体优化：
- 条件微调： 在初筛得到的阳性条件附近，精细调整pH（±0.1-0.2单位）、沉淀剂浓度（±1-5%）、蛋白/配体浓度、添加剂浓度等。
- 添加剂筛选： 在优化条件中加入不同添加剂（如PEG类、盐类、小分子化合物）。
- 晶种法： 使用Apo晶体或早期共晶体的微晶作为晶种，引入到新的结晶滴中，促进更大、更高质量的晶体生长。
- 温度优化： 尝试不同温度（如4°C, 12°C, 18°C, 室温）。

四、关键挑战与对策

小分子溶解度低：
- 尝试不同溶剂（DMSO、甲醇、乙醇）。
- 使用共溶剂（如低浓度DMSO）帮助溶解。
- 尝试更高亲和力的类似物（如果可用）。
- 降低沉淀剂浓度（但可能牺牲结晶概率）。
蛋白结合小分子后结晶性变差：
- 仔细优化缓冲液成分和pH。
- 系统筛选添加剂。
- 尝试不同的蛋白构建体（如截短体、融合标签）。
- 尝试共结晶法之外的浸泡法。
晶体衍射质量差：
- 优化晶体生长条件（见上文优化部分）。
- 尝试晶种法。
- 优化冷冻保护步骤（见下文）。
- 检查晶体是否确实是共晶（可能混入Apo晶）。
假阳性（晶体中无配体）：
- 确保配体浓度足够高（远高于Kd）。
- 延长预孵育时间或尝试共溶解法。
- 检查配体稳定性。
- 最终依靠X射线衍射确认。

五、后续步骤：数据收集与结构解析

晶体冷冻：
- 筛选合适的冷冻保护液（通常是在母液中添加20-30%的甘油、乙二醇、糖类等）。
- 快速将晶体转移至冷冻保护液中短暂浸泡（秒到分钟级）。
- 用尼龙环或微型铲捞取晶体，快速浸入液氮中冷冻。
X射线衍射数据收集：
- 在同步辐射光源或实验室X射线源上收集衍射数据。
- 优化数据收集策略（如曝光时间、角度范围、晶体取向）。
数据处理与结构解析：
- 使用软件处理衍射数据（指标化、积分、标度）。
- 通过分子置换（利用已知的Apo结构）或从头开始解析相位。
- 构建和优化模型，包括蛋白、小分子配体、水分子和离子。
- 验证结构模型的准确性（R因子、Rfree、几何参数、电子密度吻合度）。